पूर्ण लंबाई व्यक्तिगत वायरल अनुक्रमण (फ्लिप्स) पूर्ण लंबाई के निकट (बरकरार और दोषपूर्ण) एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए एक कुशल और उच्च प्रवाह विधि प्रदान करता है और उनकी क्षमता के निर्धारण के लिए अनुमति देता है प्रतिकृति-योग्यता । फ्लिप्स पिछले परख अव्यक्त एचआईवी अनुक्रम-1 जलाशय डिजाइन की सीमाओं पर काबू पा जाता है ।
पूर्ण लंबाई व्यक्तिगत वायरल अनुक्रमण (फ्लिप्स) परख एक कुशल और उच्च प्रवाह को बढ़ाना और अनुक्रम एकल, पूर्ण लंबाई के पास (बरकरार है और दोषपूर्ण), एचआईवी-1 वायरस के पास डिजाइन विधि है । फ्लिप एक सेल जनसंख्या के भीतर एकीकृत एचआईवी-1 के आनुवंशिक संरचना का निर्धारण की अनुमति देता है । एचआईवी के भीतर दोषों की पहचान के माध्यम से-1 वायरल अनुक्रम है कि रिवर्स प्रतिलेखन के दौरान उठता है, ऐसे बड़े आंतरिक विलोपन के रूप में, बचके stop codons/hypermutation, frameshift उत्परिवर्तनों, और उत्परिवर्तनों/सीआईएस में विलोपन अभिनय तत्वों की आवश्यकता विरिअन परिपक्वता के लिए, फ्लिप्स प्रतिकृति के अक्षम एकीकृत वायरसों की पहचान कर सकते हैं । फ्लिप परख एचआईवी की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है-1 वायरस है कि इन दोषों की कमी है और इसलिए संभावित प्रतिकृति सक्षम । फ्लिप्स प्रोटोकॉल शामिल हैं: एचआईवी के lysis-1 संक्रमित कोशिकाओं, निकट पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस (एचआईवी-१ ५ ‘ और 3 ‘ लीटर), डीएनए शुद्धिकरण और ठहराव, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय तैयारी (NGS), NGS, के लिए लक्षित प्राइमरों के नेस्टेड पीसीआर का उपयोग de नोवो असेंबली के वायरल contigs, और प्रतिकृति सक्षम वायरस की पहचान करने के लिए उंमूलन की एक सरल प्रक्रिया । फ्लिप्स पारंपरिक ऐसे एकल-वायरल अनुक्रमण के रूप में एचआईवी-1 वायरस, अनुक्रम के लिए डिजाइन तरीकों पर लाभ प्रदान करता है । प्रवर्धक और पूर्ण लंबाई के पास जुगाड़ के पास reviews प्रतिकृति क्षमता को सक्षम करने के लिए निर्धारित किया जाना है, और भी कम प्रवर्धन प्राइमरों का उपयोग करता है, प्राइमर बेमेल के परिणामों को रोकने । फ्लिप्स एकीकृत एचआईवी के आनुवंशिक परिदृश्य को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, विशेष रूप से अव्यक्त जलाशय के भीतर 1 वायरस, तथापि, इसके उपयोग किसी भी आवेदन जिसमें एकीकृत एचआईवी की आनुवंशिक संरचना-1 की आवश्यकता है के लिए विस्तार कर सकते हैं ।
अव्यक्त एचआईवी के आनुवंशिक लक्षण-1 जलाशय, जो दीर्घकालिक एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (कला) पर व्यक्तियों में बनी हुई है समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि एकीकृत वायरस के बहुमत दोषपूर्ण और प्रतिकृति हैं-अक्षम1 , 2. रिवर्स प्रतिलेखन की प्रक्रिया के दौरान, त्रुटियों को एकीकृत वायरल अनुक्रम में पेश कर रहे हैं । कुछ तंत्र है कि दोषपूर्ण वायरल अनुक्रम उत्पंन त्रुटि प्रवण एचआईवी-1 रिवर्स transcriptase एंजाइम3, टेंपलेट4स्विचन, और/या APOBEC-प्रेरित hypermutation5,6शामिल हैं । दो हाल के अध्ययनों से पता चला है कि लगभग एचआईवी के 5%-1 दीर्घकालिक कला पर व्यक्तियों से अलग वायरस आनुवंशिक रूप से बरकरार हैं, और संभावित प्रतिकृति-सक्षम है, और तेजी से खुशहाली लौटने लगी एचआईवी में योगदान कर सकते है-कला की समाप्ति पर 1 प्लाज्मा स्तर 1 , 2 , 7. पिछले अध्ययनों की पहचान की है कि प्रतिकृति सक्षम एचआईवी-1 वायरस भोली और आराम स्मृति CD4+ टी सेल सबसेट में जारी रहती है (केंद्रीय, संक्रमणकालीन और प्रभाव स्मृति टी कोशिकाओं सहित), के महत्व का संकेत भविष्य उंमूलन रणनीतियों2,8,9में इन कोशिकाओं को लक्षित ।
वितरण, गतिशीलता और अव्यक्त एचआईवी-1 जलाशय के रखरखाव में प्रारंभिक अंतर्दृष्टि एकल-वायरल sequencing (एसपीएस) तरीकों कि आनुवंशिक रूप से उप-जीनोमिक क्षेत्रों एचआईवी-1 जीनोम10 की विशेषताएं के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया गया ,११,१२,१३. एसपीएस एक बहुमुखी उपकरण है, एक एकल संक्रमित कोशिका के भीतर से एक एकल एचआईवी-1 वायरस अनुक्रम में सक्षम है । हालांकि, एसपीएस प्रतिकृति-की क्षमता का निर्धारण करने में असमर्थ है, क्योंकि यह केवल उप जीनोमिक क्षेत्रों अनुक्रम और याद करते है कि प्राइमर बंधन साइटों के भीतर बड़े विलोपन शामिल है । एक पिछले अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि एसपीएस 13-से 17-के लिए सक्षम जलाशय के आकार का अनुमान है चुनिंदा अनुक्रमण बरकरार उप जीनोमिक क्षेत्रों2के माध्यम से गुना ।
एसपीएस की सीमाओं का पता करने के लिए, हो एट अल । 4 और ब्रूनर एट अल. 1 पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के पास अनुक्रम को परख विकसित की है । यह आनुवंशिक रूप से बरकरार की आवृत्ति की अनुमति दी, और संभावित प्रतिकृति-सक्षम, एचआईवी-1 दीर्घकालिक कला पर व्यक्तियों में वायरस निर्धारित किया जाना है । इन परख प्रवर्धित और (सैंज अनुक्रमण के द्वारा) उप जीनोमिक क्षेत्रों है कि तो (बरकरार या दोषपूर्ण) एचआईवी-1 वायरस के एक अनुक्रम प्राप्त इकट्ठे हुए थे अनुक्रम । इस दृष्टिकोण की तीन सीमाएं हैं: 1) कई sequencing प्राइमरों का उपयोग अनजाने में वायरल अनुक्रम में दोष शुरू करने का खतरा बढ़ जाता है, 2) प्राइमर बेमेल विशेष रूप से वायरस के प्रवर्धन को रोका जा सकता है, और 3) अक्सर पूरे वायरल अनुक्रम इन तरीकों की तकनीकी के कारण हल नहीं किया जा सकता है ।
मौजूदा पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरल अनुक्रमण परख की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एफull-Length मैंndividual पीroviral एसequencing (फ्लिप्स) परख विकसित की है । फ्लिप्स एक उच्च प्रवाह और कुशल तरीके से पूर्ण लंबाई (बरकरार या दोषपूर्ण) एचआईवी-1 के पास परिवर्धित और दृश्यों जो प्रवर्धक और एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS)-आधारित परख है । फ्लिप्स पिछले परख पर लाभ प्रदान करता है, के रूप में यह उपयोग प्राइमरों की संख्या सीमा; इसलिए, यह प्राइमर बेमेल है, जो की आबादी को सीमित कर सकते है की संभावना कम हो जाती है पर कब्जा कर लिया या अनजाने में एक वायरल अनुक्रम में दोषों का परिचय । फ्लिप्स भी कम तकनीकी तौर पर पिछले परख से चुनौतीपूर्ण है और 6 मुख्य कदम शामिल है: 1) एचआईवी के lysis-1 संक्रमित कोशिकाओं, 2) एकल एचआईवी के प्रवर्धन-1 नेस्टेड पीसीआर के माध्यम से वायरस अत्यधिक संरक्षित के लिए विशिष्ट प्राइमरी का उपयोग कर सीमित पर प्रदर्शन किया एचआईवी-१ ५ ‘ और 3 ‘ U5 बाएं से दाएं क्षेत्र (आंकड़ा 1a), 3) शुद्धि और प्रवर्धित उत्पादों के ठहराव, 4) NGS के लिए प्रवर्धित वायरस के पुस्तकालय की तैयारी, 5) NGS, और 6) के लिए प्रत्येक के contigs प्राप्त करने के लिए sequenced वायरस के de नोवो असेंबली व्यक्तिगत वायरस ।
फ्लिप द्वारा उत्पंन अनुक्रम उन्मूलन के एक कड़े प्रक्रिया से गुजरना कर सकते है जो उन की पहचान करने के लिए जो आनुवंशिक रूप से बरकरार है और संभावित प्रतिकृति-सक्षम (चित्रा 1C)2। आनुवंशिक रूप से बरकरार है, जो एक प्रतिकृति अक्षम वायरस की पीढ़ी में परिणाम सभी ज्ञात दोषों की कमी है । इन दोषों में शामिल हैं: उलटा दृश्यों, बड़े आंतरिक विलोपन, hypermutation/बचके रोक codons, frameshifts, या 5 ‘ पैकेजिंग संकेत या प्रमुख ब्याह दाता (एमएसडी) साइट में उत्परिवर्तनों ।
चित्रा 1: पूर्ण लंबाई व्यक्तिगत वायरल अनुक्रमण में महत्वपूर्ण कदम (फ्लिप्स) परख । (क) एचआईवी-1 में प्राइमर बाध्यकारी साइटों के साथ डीएनए जीनोम ‘ और 3 ‘ U5 लीटर फ्लिप द्वारा इस्तेमाल के लिए पूरी लंबाई के पास बढ़ाना (दोषपूर्ण और बरकरार) एचआईवी-1 वायरस नेस्टेड पीसीआर के माध्यम से । (ख) एक ९६-well पीसीआर प्लेट का लेआउट ८० नमूना कुओं (प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए 20 कुओं), 4 नकारात्मक नियंत्रण कुओं, और 1 सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से युक्त । (ग) आनुवंशिक रूप से बरकरार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया उंमूलन की प्रक्रिया, और संभावित प्रतिकृति-सक्षम, एचआईवी-1 वायरस । यह आंकड़ा Hiener एट अल से संशोधित किया गया है । 2 . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
फ्लिप्स परख बढ़ाना और अनुक्रमण एकल के लिए एक कुशल और उच्च प्रवाह विधि, पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 के पास वायरस है । संख्या और प्राप्त अनुक्रम की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाले प्रोटोकॉल में कई कारकों और महत्वपूर्ण चरणों की पहचान की गई है । सबसे पहले, कोशिकाओं की संख्या और एचआईवी-1 कोशिका जनसंख्या के संक्रमण की आवृत्ति को प्रभावित करने वाले वायरस की संख्या का प्रभाव । उदाहरण के लिए, पिछले प्रकाशन में, लगभग आधे के रूप में कई दृश्यों का एक ही नंबर से प्राप्त किया गया था भोली CD4+ टी कोशिकाओं की तुलना में प्रभाव स्मृति CD4+ टी कोशिकाओं. यह इसलिए है क्योंकि भोली कोशिकाओं आमतौर पर प्रभाव स्मृति कोशिकाओं2से एक कम संक्रमण आवृत्ति है । दूसरे, कोशिका lysis जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए कॉलम आधारित निष्कर्षण तरीकों के लिए बेहतर है के रूप में वहां निष्कर्षण प्रक्रिया में डीएनए खोने का कोई खतरा नहीं है । अंत में, किसी भी पीसीआर आधारित परख के साथ के रूप में, प्रदूषण को रोकने के महत्वपूर्ण है । अलग साफ क्षेत्रों मास्टर घोला जा सकता है की तैयारी के लिए नामित किया जाना चाहिए, जीनोमिक डीएनए से निपटने, सकारात्मक नियंत्रण जोड़ने, डीएनए शुद्धि और ठहराव, और पुस्तकालय की तैयारी. यह एक यहां प्रस्तुत के रूप में एक प्रतिलिपि परख के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ।
फ्लिप्स परख के कार्यांवयन पहले ऐसे pNL4 के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण चल शामिल होना चाहिए-3 plasmids बजाय भागीदार नमूने । यह एचआईवी के उपयोग से पहले किसी भी समस्या निवारण के लिए अनुमति देगा-1 सकारात्मक कोशिकाओं, के रूप में प्राप्त अनुक्रम इन plasmids के लिए उपलब्ध संदर्भ दृश्यों की तुलना में किया जा सकता है । जब एचआईवी-1 सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग कर, यह महत्वपूर्ण है एचआईवी-1 उपप्रकार (फ्लिप्स के लिए डिज़ाइन किया गया प्राइमरों के लिए डिजाइन उप प्रकार बी के लिए विशिष्ट हैं) और कोशिका की आबादी के संक्रमण आवृत्ति यदि कोई वायरस से परिलक्षित कर रहे हैं । प्राइमरी दृश्यों अंय उपप्रकारों के मिलान के लिए संशोधित/ इसके अतिरिक्त, एक अच्छी तरह से युक्त एक सकारात्मक नियंत्रण हर पीसीआर में शामिल किया जाना चाहिए ।
फ्लिपों एसपीएस सहित पिछले अनुक्रमण परख की सीमाओं को दूर किया है । के माध्यम से बढ़ाना और पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के पास अनुक्रमण, फ्लिप संभावित प्रतिकृति-एचआईवी की क्षमता-1 वायरस निर्धारित कर सकते हैं । यह संभव एसपीएस, जो केवल उप जीनोमिक क्षेत्रों अनुक्रम और इसलिए बरकरार प्राइमर बंधन साइटों के साथ दृश्यों के लिए चयनित का उपयोग नहीं किया गया । इसके अलावा, फ्लिप्स कई प्रवर्धन और अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग करने के साथ जुड़े सीमाओं पर काबू पाता है, के रूप में पिछले पूर्ण लंबाई अनुक्रमण परख1,4द्वारा नियोजित किया गया था । NGS के साथ संयुक्त एचआईवी-1 लीटर क्षेत्रों को लक्षित पीसीआर के दो दौर के माध्यम से, फ्लिप आवश्यक संख्या और प्राइमरों की जटिलता कम हो जाती है । फ्लिप्स इसलिए कम प्राइमर बेमेल के परिणामों के लिए अतिसंवेदनशील है, अर्थात् दोषपूर्ण वायरसों की गलत पहचान और एक आबादी के भीतर कुछ वायरस बढ़ाना अक्षमता… फ्लिप्स प्रोटोकॉल भी अधिक कुशल है और पिछले तरीकों की तुलना में अनुक्रमण के एक उच्च प्रवाह के लिए अनुमति देता है ।
जाहिर है, फ्लिप्स मौजूदा तरीकों पर लाभ प्रदान करता है कि एचआईवी के आनुवंशिक संरचना-1 वायरस का निर्धारण । हालांकि, यह फ्लिप की सीमाओं को स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे पहले, फ्लिप परख अव्यक्त एचआईवी के आकार को मापने के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित नहीं किया गया है-1 जलाशय, विश्लेषण के रूप में निर्धारित करने के लिए कि क्या फ्लिप हर एचआईवी-1 एक सेल आबादी में मौजूद वायरस प्रवर्धक पूरा नहीं किया गया है । फ्लिप्स अलग कोशिका आबादी2के बीच जलाशय की संरचना की तुलना रिश्तेदार बनाने के लिए बजाय उपयोगी है । दूसरे, प्रतिकृति बरकरार एचआईवी की क्षमता-1 वायरस के बिना निश्चितता के साथ निर्धारित नहीं किया जा सकता है vivo विश्लेषण में , ऐसे हो एट अल द्वारा प्रदर्शन के रूप में । 4. तीसरे, फ्लिप एचआईवी के एकीकरण साइट-1 वायरस का निर्धारण करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है ।
फ्लिपर्स प्रोटोकॉल के लिए मामूली बदलाव अपने आवेदन को बढ़ा सकते हैं । उदाहरण के लिए, प्राइमरी दृश्यों में परिवर्तन अलग और कई एचआईवी-1 उपप्रकार को परिवर्धित और अनुक्रम की अनुमति दे सकते हैं । प्लाज्मा एचआईवी-1 virions के अनुक्रमण सीडीएनए संश्लेषण के अलावा नेस्टेड पीसीआर से पहले के माध्यम से संभव है । एकल अणु sequencing विधियों का भविष्य उपयोग de नोवो असेंबली की आवश्यकता को समाप्त करेगा ।
एकीकृत एचआईवी के आनुवंशिक अनुक्रमण-1 वायरस अव्यक्त एचआईवी-1 जलाशय की हमारी समझ में वृद्धि हुई है । फ्लिपों संरचना और अव्यक्त जलाशय के वितरण elucidating भविष्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । हालांकि, फ्लिप के आवेदन जलाशय से परे का विस्तार कर सकते हैं । भविष्य के अध्ययन CRISPR-कैस प्रौद्योगिकी के लिए विशेष लक्ष्य निर्धारित करने के लिए फ्लिप का उपयोग कर सकते हैं, या कोडिंग और गैर कोडिंग क्षेत्रों जो वायरस और अधिक विलंबता reversing एजेंटों के लिए उत्तरदायी बनाने की पहचान में सहायता करते हैं । बड़े आंतरिक विलोपन के जंक्शन स्थलों को देखकर वायरल का पुनर्संयोजन बेहतर समझा जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए एक इलाज खोजने के लिए (1U19AI096109 और 1UM1AI126611-01) लेन-देने एड्स अनुसंधान उद्यम (हिम्मत) का समर्थन किया था; एचआईवी उन्मूलन पर एक amfAR अनुसंधान कंसोर्टियम (आर्क) एड्स अनुसंधान के लिए फाउंडेशन से सहयोगात्मक अनुसंधान अनुदान (amfAR 108074-50-RGRL); ऑस्ट्रेलियन सेंटर फॉर एचआईवी एण्ड हेपेटाइटिस वायरोलॉजी रिसर्च (2); UCSF-GIVI सेंटर फॉर एड्स रिसर्च (P30 AI027763); और ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (AAP1061681) । हम पुस्तकालय की तैयारी और उसकी सुविधा के उपयोग में अपने प्रशिक्षण के लिए चिकित्सा अनुसंधान के लिए Westmead संस्थान में Dr. जॉय लाइ, जीनोमिक्स सुविधा प्रबंधक का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और जीनोमिक्स के लिए Ramaciotti केंद्र (ंयू साउथ वेल्स, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया के विश्वविद्यालय) अनुक्रमण के संचालन के लिए । हम आभार प्रतिभागियों जो इस अध्ययन के लिए नमूने दान के साथ स्वीकार करते हैं ।
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |