Full lengde personlige proviral sekvenser (vende) gir en effektiv og høy gjennomstrømming metode for forsterkning og sekvensering av enkeltrom, nær full lengde (intakt og defekt) HIV-1 proviruses og gir mulighet for fastsettelse av sitt potensial replikering-kompetanse. KNIPSER overvinner begrensninger av tidligere analyser for sekvens latente HIV-1 reservoaret.
Full-Length personlige Proviral sekvensering (vende) analysen er en effektiv og høy gjennomstrømming metode utviklet for å forsterke og sekvens singel, nær full lengde (intakt og defekt), HIV-1 proviruses. VENDER tillater fastsetting av genetiske sammensetningen av integrert HIV-1 i cellen innbyggere. Gjennom identifiserer mangler innen HIV-1 proviral sekvenser som oppstår under omvendt transkripsjon, for eksempel store interne sletting, skadelige stopp kodon/hypermutation, frameshift mutasjoner og mutasjoner/slettinger i cis opptrer elementer nødvendig for virion modning, kan KNIPSER identifisere integrert proviruses stand til replikering. FLIPS analysen kan brukes til å identifisere HIV-1 proviruses som mangler disse feilene og er derfor potensielt replikering kompetente. FLIPS protokollen innebærer: lysis av HIV-1-infiserte celler, nestede PCR av nær full lengde HIV-1 proviruses (bruker primere rettet mot HIV-1-5′ og 3′ LTR), DNA rensing og kvantifisering, bibliotek forberedelser for neste generasjons sekvensering (NGS), NGS, de novo montering av proviral contigs, og en enkel prosess med eliminasjon identifisere replikering kompetente proviruses. KNIPSER gir fordeler fremfor tradisjonelle metoder for sekvensen integrert HIV-1 proviruses, som enkelt-proviral sekvenser. KNIPSER forsterker og sekvenser i nærheten fulle proviruses slik at replikering kompetanse være bestemt, og bruker også færre forsterkning primere, forebygge konsekvensene av primer uoverensstemmelser. VENDE er et nyttig verktøy for å forstå genetisk landskapet av integrert HIV-1 proviruses, spesielt i latente reservoaret, men dens utnyttelse kan utvide til programmer som genetiske sammensetningen av integrert HIV-1 er nødvendig.
Genetisk karakteristikk av det latente HIV-1-reservoaret, som vedvarer i individer på langsiktige antiretroviral terapi (ART), er viktig å forstå at fleste integrert proviruses er defekt og replikering-inkompetente1 , 2. under prosessen med omvendt transkripsjon, feil er innført i integrert proviral sekvensen. Noen mekanismer som genererer defekt proviral sekvenser inkluderer den feilutsatte HIV-1 revers transkriptase enzym3, mal bytte4og/eller APOBEC-indusert hypermutation5,6. To nyere studier har funnet at ca 5% av HIV-1 proviruses isolert fra individer på langsiktige ART genetisk intakt, og potensielt replikering kompetente, og kan bidra til rask oppsving i HIV-1 Plasmanivåer ved opphør av kunst 1 , 2 , 7. forrige studier har identifisert at replikering kompetente HIV-1 proviruses vedvarer i naiv og hvile minne CD4+ T celle delsett (inkludert central, overgang og effektor minne T celler), som indikerer viktigheten av målretting disse cellene i fremtiden utrydding strategier2,8,9.
Tidlig innsikt i distribusjon, dynamikk og vedlikehold av latent HIV-1 reservoaret ble oppnådd gjennom utnyttelse av enkelt-proviral sekvenser (SPS) metoder som karakteriserer genetisk sub-genomisk regioner av HIV-1 genomet10 ,11,12,13. SPS er et allsidig verktøy, kunne sekvens en enkelt HIV-1 provirus fra i én infisert celle. SPS er imidlertid ikke fastslå replikering-kompetansen til proviruses, siden det bare sekvenser sub-genomisk regioner og savner proviruses som inneholder store slettinger i primer bindende områder. En tidligere studie har vist at SPS overvurderer størrelsen på Replikasjons-kompetent reservoaret av 13 – til 17 ganger gjennom selektivt sekvensering intakt sub-genomisk regioner2.
Å løse begrensningene for SPS, Ho et al. 4 og Bruner et al. 1 utviklet analyser sekvensen i full lengde HIV-1 proviruses. Dette tillot frekvensen av genetisk intakt, og potensielt replikering-kompetent, HIV-1 proviruses i individer på langsiktige kunst bestemmes. Disse analyser forsterket og sekvensert (via Sanger sekvensering) sub-genomisk områder som da var forsamlet for å få en sekvens (intakt eller defekt) HIV-1 provirus. Tre begrensninger av denne tilnærmingen er: 1) bruk av flere sekvensering primere øker risikoen for utilsiktet innføre defekter i proviral sekvensen, 2) primer uoverensstemmelser kan hindre forsterkning av bestemt proviruses, og 3) ofte den hele proviral sekvensen kan ikke løses på grunn av teknisk på disse metodene.
For å overvinne begrensninger av eksisterende full lengde HIV-1 proviral sekvensering analyser, utviklet vi Full –Llange jegndividual Proviral Sequencing (vende) analysen. VENDE er en neste generasjons sekvensering (NGS)-basert analysen som forsterker og sekvenser i nærheten full lengde (intakt eller defekt) HIV-1 proviruses i en høy gjennomstrømming og effektiv måte. KNIPSER gir fordeler over tidligere analyser, som begrenser antall primere brukt; Derfor reduserer det sjansen for primer konflikter, noe som kan begrense befolkningen i proviruses fanget eller utilsiktet innføre defekter i en viral sekvens. VENDE er også mindre teknisk utfordrende enn tidligere analyser og innebærer 6 hovedtrinn: 1) lysis av HIV-1-infiserte celler, 2) forsterkning av enkelt HIV-1 proviruses via nestede PCR på begrense fortynning bruker primere bestemt av høyt konservert HIV-1 5′ og 3 U5 LTR regionen (figur 1A), 3) rensing og kvantifisering av forsterket produkter, 4) bibliotek utarbeidelse av forsterket proviruses for NGS, 5) NGS, og 6) de novo montering av sekvensert proviruses å få contigs av hver Personlige provirus.
Sekvenser generert av FLIPS kan gjennomgå en strenge elimineringsprosess å identifisere dem som er genetisk intakt og potensielt replikering kompetente (figur 1 c)2. Genetisk intakt proviruses mangler alle kjente defekter som føre generasjon av en replikering-inkompetente provirus. Disse feilene inkluderer: inversjon sekvenser, store interne slettinger, hypermutation/skadelige stopp kodon, frameshifts eller mutasjoner i de 5′ emballasje signal eller større skjøte donor (MSD) nettsted.
Figur 1: avgjørende skritt i full lengde personlige proviral sekvenser (vende) analysen. (A) HIV-1 DNA genomet med primer bindende områder i 5′ og 3 U5 LTR områder brukes av FLIPS for å forsterke nær full lengde (defekt og intakt) HIV-1 proviruses via nestede PCR. (B) Layout av en 96-brønns PCR plate som inneholder 80 eksempel brønner (20 brønner for hver fortynning), 4 negativ kontroll brønner og 1 positiv kontroll godt. (C) elimineringsprosess brukes til å identifisere genetisk intakt, og potensielt replikering-kompetent, HIV-1 proviruses. Dette tallet har blitt endret fra Hiener et al. 2 . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
FLIPS analysen er en effektiv og høy gjennomstrømming metode for forsterke og sekvensering singel, nær full lengde HIV-1 proviruses. Flere faktorer og avgjørende skritt i protokollen som påvirker antallet og kvaliteten av sekvenser innhentet har blitt identifisert. Først påvirker antall celler og HIV-1 smitte frekvensen av befolkningen cellen antall proviruses forsterket. For eksempel i en tidligere publikasjon, omtrent halvparten så mange sekvenser Hentet fra samme antall naiv CD4+ T celler sammenlignet effektor minne CD4+ T celler. Dette er fordi naiv celler har vanligvis en lavere infeksjon frekvens enn effektor minne celler2. Deretter er cellen lysis å foretrekke fremfor kolonne-baserte utvinning metoder for å skaffe genomisk DNA som det er ingen risiko for å miste DNA i utpakkingen. Til slutt, som med alle PCR-baserte analysen, hindre forurensning er avgjørende. Atskilt rengjøre områder bør angis for å forberede master mikser, håndtering genomisk DNA, legge til positiv kontroller, DNA rensing og kvantifisering og biblioteket forberedelse. Dette er spesielt viktig for enkelt-kopi analyser som det som presenteres her.
Implementering av FLIPS analysen bør først ta kjører en positiv kontroll som pNL4-3 plasmider i stedet for deltaker prøver. Dette vil tillate noen feilsøking før bruk av HIV-1 positiv celler, som sekvensene innhentet kan sammenlignes referanse sekvenser for disse plasmider. Når du bruker HIV-1 positiv celler, er det viktig å vurdere HIV-1 subtype (primere designet for FLIPS gjelder undertype B) og infeksjon frekvensen av befolkningen cellen hvis liten eller ingen proviruses er forsterket. Primer sekvenser kan være endret/redesigned å matche andre undertyper. I tillegg bør en godt inneholder en positiv kontroll inkluderes i hver PCR utført.
KNIPSER har overvinne begrensningene til tidligere sekvensering analyser, inkludert SPS. Gjennom forsterke og sekvensering nær full lengde HIV-1 proviruses, kan KNIPSER finne potensielle replikering-kompetansen til HIV-1 proviruses. Dette var ikke mulig å bruke SPS, som sekvensert bare sub-genomisk regioner og derfor valgt for sekvenser med intakt primer bindende områder. Videre FLIPS løser begrensningene knyttet utnytte flere forsterkning og sekvensering primere, som ble ansatt av tidligere full lengde sekvenser analyser1,4. Gjennom to runder av PCR målretting av HIV-1 LTR kombinert med NGS FLIPS reduserer antallet og kompleksiteten i primere kreves. VENDE er derfor mindre utsatt for konsekvensene av primer uoverensstemmelser, nemlig feil identifisering av defekte proviruses og en manglende evne til å forsterke noen proviruses i en befolkning. FLIPS protokollen er også mer effektivt og gir en høyere frekvens av sekvensering enn tidligere metoder.
Tydeligvis FLIPS gir fordelene over eksisterende metoder som bestemmer den genetiske sammensetningen av HIV-1 proviruses. Det er imidlertid viktig å erkjenne begrensninger av KNIPSER. Først har FLIPS analysen ikke blitt utviklet som et verktøy for å måle størrelsen på latente HIV-1 reservoaret som analyser for å avgjøre om FLIPS forsterker hver HIV-1 provirus i en celle befolkningen ikke er fullført. VENDE er stedet nyttig for relativ sammenlikner sammensetningen av reservoaret mellom ulike celle populasjoner2. Dernest kan ikke replikering-kompetansen til intakt HIV-1 proviruses fastslås med sikkerhet uten i vivo analyser, som utføres av Ho et al. 4. det tredje FLIPS er ikke utformet til å bestemme området integrering av HIV-1 proviruses.
Mindre variasjoner av FLIPS protokollen kan øke sin søknad. For eksempel endringer i primer sekvenser kan tillate forskjellige og flere HIV-1 subtyper forsterket og sekvensielt. Sekvensering av plasma HIV-1 virions er mulig gjennom tillegg av cDNA syntese før nestede PCR. Fremtidige utnyttelse av ett molekyl sekvensering metoder vil eliminere behovet for de novo montering.
Genetisk sekvensering av integrert HIV-1 proviruses har økt vår forståelse av latent HIV-1 reservoaret. VENDE er et viktig verktøy for fremtidige studier Klargjørende sammensetning og distribusjon av latent reservoaret. Men kan anvendelsen av FLIPS utvide utover reservoaret. Fremtidige studier kan benytte FLIPS å bestemme bestemte mål for CRISPR-Cas-teknologi, eller bistå i identifiseringen av koding og ikke-koding regioner som gjør at viruset raskere å latency reversere agenter. Viral rekombinasjon kan bli bedre forstått av ute ved krysset store interne slettinger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) å finne en kur (1U19AI096109 og 1UM1AI126611-01); en amfAR forskning Consortium på HIV utrydding (ARCHE) samarbeid forskningsstipend fra stiftelsen for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australsk senter for HIV og hepatitt virologi forskning (ACH2); UCSF-ga senter for AIDS Research (P30 AI027763); og Australian National Health and Medical Research Council (AAP1061681). Vi vil gjerne takke Dr. Joey Lai, Genomics anlegget Manager ved Westmead Institutt for medisinsk forskning på sin opplæring i biblioteket utarbeidelse og bruk av sin anlegget og Ramaciotti senter for Genomics (University i New South Wales i Sydney, Australia) for å gjennomføre sekvensering. Vi erkjenner med takknemlighet deltakerne som donerte prøver for denne studien.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |