Fuld længde individuelle proviral sekventering (FLIPS) giver en effektiv og høj overførselshastighed metode til forstærkning og sekventering af enkelt, nær fuld længde (intakt og defekte) HIV-1 provirus og giver mulighed for bestemmelse af deres potentiale replikering-kompetence. FLIPS overvinder begrænsningerne af tidligere assays designet til sekvens latent HIV-1 reservoiret.
Fuld-længde individuelle Proviral sekventering (FLIPS) assay er en effektiv og høj overførselshastighed metoden er designet til at forstærke og sekvens enkelt, nær fuld længde (intakt og defekt), HIV-1 provirus. FLIPS giver mulighed for bestemmelse af den genetiske sammensætning af integrerede HIV-1 inden for en celle population. Ved at identificere fejl i HIV-1 proviral sekvenser, der opstår under reverse transkription som store interne sletninger, skadelige stop kodon/hypermutation, frameshift mutationer og mutationer/sletninger i cis handler elementer kræves for virion modning, kan FLIPS identificere integreret provirus stand til replikering. FLIPS assay kan udnyttes til at identificere HIV-1 provirus, der mangler disse mangler og er derfor potentielt replikationskompetente. FLIPS protokollen indebærer: lysis af HIV-1-inficerede celler, indlejret PCR af nær fuld længde HIV-1 provirus (ved hjælp af primere målrettet mod HIV-1-5′ og 3′ LTR), DNA oprensning og kvantificering, bibliotek forberedelse til næste generation Sequencing (NGS), NGS, de novo forsamling af proviral contigs, og en enkel proces udelukkelsesmetoden til at identificere replikationskompetente provirus. FLIPS giver fordele i forhold til traditionelle metoder designet til sekvens integreret HIV-1 provirus, såsom single-proviral sekventering. FLIPS forstærker og sekvenser nær fuld længde provirus muliggør replikation kompetence skal fastsættes, og også bruger færre forstærkning primere, forebygge konsekvenserne af primer uoverensstemmelser. VIPPER er et nyttigt værktøj til at forstå den genetiske landskab af integrerede HIV-1 provirus, især inden for den latente reservoir, men dens udnyttelse kan udvides til enhver anvendelse, hvor den genetiske sammensætning af integrerede HIV-1 er påkrævet.
Genetisk karakterisering af latent HIV-1-reservoiret, som fortsætter i individer på langsigtede antiretroviral behandling (ART), har været afgørende for forståelsen, at størstedelen af integrerede provirus er defekt og replikation-inkompetente1 , 2. i processen med reverse transkription, fejl er indført i den integrerede proviral sekvens. Nogle mekanismer, der genererer defekte proviral sekvenser omfatter den fejlbehæftede HIV-1 omvendt transkriptase enzym3, skabelon skifter4, og/eller APOBEC-induceret hypermutation5,6. To nylige undersøgelser har fundet at ca 5% af HIV-1 provirus isoleret fra enkeltpersoner om langsigtede kunst er genetisk intakt, og potentielt replikationskompetente, og kan bidrage til den hurtige rebound i HIV-1 plasmaniveauer ved ophør af kunst 1 , 2 , 7. tidligere undersøgelser har identificeret, at replikationskompetente HIV-1 provirus persistere i naiv og hvile memory CD4+ T celle subsets (herunder central, overgangsbestemmelser og effektor memory T celler), der angiver betydningen af målretning disse celler i fremtiden udryddelse strategier2,8,9.
Tidlig indsigt i distribution, dynamik og vedligeholdelse af latent HIV-1 reservoiret blev opnået gennem udnyttelse af single-proviral sekventering (SPS) metoder, der genetisk karakteriserer sub-genomisk regioner af HIV-1 genom10 ,11,12,13. SPS er et alsidigt værktøj, at sekventere et enkelt HIV-1 provirus fra inden for en enkelt inficeret celle. SPS er imidlertid ikke afgøre replikation-kompetence af provirus, da det kun sekvenser sub-genomisk regioner og misser provirus, der indeholder store sletninger i primer bindingssteder. En tidligere undersøgelse har vist, at SPS overvurderer størrelsen af den replikationskompetente reservoir af 13 – til 17 – gange gennem selektivt sekventering intakt sub-genomisk regioner2.
At afhjælpe begrænsningerne af SPS, Ho et al. 4 og Bruner et al. 1 udviklet assays til sekvens nær fuld længde HIV-1 provirus. Dette tillod hyppigheden af genetisk intakt, og potentielt replikationskompetente, HIV-1 provirus i individer på langsigtet ART skal fastlægges. Disse assays forstærkes og sekventeret (via Sanger sekventering) sub-genomisk regioner, der blev derefter samles for at opnå en sekvens af (intakt eller defekt) HIV-1 provirus. Tre begrænsninger af denne tilgang er: 1) anvendelsen af flere sekventering primere øger risikoen for utilsigtet Introduktion defekter i proviral rækkefølge, 2) primer uoverensstemmelser kan forhindre forstærkning af særlige provirus, og 3) ofte den hele proviral sekvens ikke kan løses på grund af teknisk detalje af disse metoder.
For at overvinde begrænsningerne af eksisterende fuld længde HIV-1 proviral sekventering assays, udviklet vi Full –Llange jegNDIVIDUELLE Proviral Sequencing (FLIPS) analysen. VIPPER er en næste generation sequencing (NGS)-baseret analyse, som forstærker og sekvenser nær fuld længde (intakt eller defekt) HIV-1 provirus i en høj overførselshastighed og effektiv måde. FLIPS giver fordele i forhold til tidligere assays, da det begrænser antallet af primere udnyttet; Derfor, det mindsker chancen for primer uoverensstemmelser, der kan begrænse befolkningen i provirus fanget eller utilsigtet indføre defekter i en viral sekvens. VIPPER er også mindre teknisk udfordrende end tidligere assays og omfatter 6 vigtigste trin: 1) lysering af HIV-1-inficerede celler, 2) forstærkning af enkelt HIV-1 provirus via indlejrede PCR udføres på begrænsning ved hjælp af primere specifikke for den yderst velbevarede HIV-1 5′ og 3′ U5 LTR region (figur 1A), 3) rensning og kvantificering af forstærkede produkter, 4) bibliotek forberedelse af forstærkede provirus til NGS, 5) NGS, og 6) de novo samling af sekventeret provirus at få contigs af hver enkelte provirus.
Sekvenser genereret af FLIPS kan underkastes en streng proces udelukkelsesmetoden til at identificere dem, der er genetisk intakt og potentielt replikationskompetente (figur 1 c)2. Genetisk intakt provirus mangler alle kendte fejl, som resulterer i generation af en replikation-inkompetente provirus. Disse defekter omfatter: inversion sekvenser, store interne sletninger, hypermutation/skadelige stop kodon, frameshifts eller mutationer i de 5′ emballagen signal eller store splejse donor (MSD) websted.
Figur 1: kritisk trin i fuld længde individuelle proviral sekventering (FLIPS) analysen. (A) HIV-1 DNA genom med primer bindingssteder i 5′ og 3′ U5 LTR regioner bruges af vipper til at forstærke nær fuld længde (defekt og intakt) HIV-1 provirus via indlejrede PCR. (B) Layout af en 96-brønd PCR plade der indeholder 80 prøve wells (20 brønde for hver fortynding), 4 negative kontrolhullerne og 1 positiv kontrol godt. (C) proces udelukkelsesmetoden bruges til at identificere genetisk intakt, og potentielt replikationskompetente, HIV-1 provirus. Dette tal er blevet ændret fra Hiener et al. 2 . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
FLIPS assay er en effektiv og høj overførselshastighed metode for uddybning og sekventering single, i nærheden af fuld længde HIV-1 provirus. Flere faktorer og kritiske trin i protokollen, der har indflydelse på antallet og kvaliteten af de sekvenser, der er opnået er blevet identificeret. For det første påvirke antallet af celler og HIV-1 infektion hyppighed af befolkningens celle antallet af provirus forstærkes. For eksempel, i en tidligere publikation, cirka halvt så mange sekvenser blev indhentet fra de samme antal naive CD4+ T celler i forhold til effektor memory CD4+ T celler. Dette er fordi naive celler har typisk et lavere infektion hyppighed end effektor hukommelse celler2. For det andet, celle lysis er at foretrække frem for kolonne-baseret udvindingsmetoder for at opnå genomisk DNA, som der ikke er nogen risiko for at miste DNA i udpakningsprocessen. Endelig, som med enhver PCR-baseret analyse, forebyggelse af forurening er kritisk. Adskilte rengøre områder bør udpeges til at forberede master mix, håndtering af genomisk DNA, tilføje positive kontroller, DNA oprensning og kvantificering og bibliotek forberedelse. Dette er især vigtigt for enkelt-kopi assays som den præsenteres her.
Gennemførelsen af FLIPS analysen bør først omfatter kører en positiv kontrol såsom pNL4-3 plasmider snarere end deltager prøver. Dette gør det muligt for enhver fejlfinding forud for brugen af HIV-1 positive celler, som de sekvenser fremstillet kan sammenlignes med tilgængelige reference sekvenser for disse plasmider. Når du bruger HIV-1 positive celler, er det vigtigt at overveje undertypen HIV-1 (primere designet for FLIPS er specifikke for subtype B) og infektion hyppighed af cellen befolkningen hvis lidt at ingen provirus forstærkes. Primer sekvenser kan blive ændret/redesigned at matche andre undertyper. Derudover bør et godt indeholdende en positiv kontrol indgå i alle PCR udføres.
FLIPS har overvinde begrænsningerne af tidligere sekventering assays, herunder SPS. Gennem uddybning og sekventering nær fuld længde HIV-1 provirus, kan FLIPS bestemme den potentielle replikation-kompetence af HIV-1 provirus. Dette var ikke muligt at bruge SPS, som sekventeret kun sub-genomisk regioner og derfor valgt for sekvenser med intakt primer bindingssteder. Derudover FLIPS overvinder de begrænsninger i forbindelse med udnytter flere forstærkning og sekventering primere, som var ansat ved tidligere fuld længde sekventering assays1,4. Gennem to runder af PCR målretning HIV-1 LTR regioner kombineret med NGS, nedsætter FLIPS antallet og kompleksiteten af primere kræves. VIPPER er derfor mindre modtagelige for konsekvenserne af primer uoverensstemmelser, nemlig en fejlagtig identifikation af defekte provirus og manglende evne til at forstærke nogle provirus inden for en befolkning. FLIPS protokol er også mere effektive og giver mulighed for en højere overførselshastighed på sekventering end tidligere metoder.
Åbenbart, FLIPS giver fordele i forhold til eksisterende metoder, der bestemmer den genetiske sammensætning af HIV-1 provirus. Det er imidlertid vigtigt at anerkende begrænsninger af vipper. For det første er FLIPS analysen ikke udviklet som et redskab til måling af størrelsen af den latent HIV-1 reservoir, som analyser til at bestemme, om FLIPS forstærker alle HIV-1 provirus findes i en celle befolkning ikke er afsluttet. FLIPS bruges i stedet for relative sammenligninger af sammensætningen af reservoir mellem forskellige celle populationer2. For det andet, replikation-kompetence af intakt HIV-1 provirus kan ikke bestemmes med sikkerhed uden i vivo analyser, som dem, der udføres af Ho et al. 4. for det tredje, FLIPS er ikke designet til at bestemme webstedet integration af HIV-1 provirus.
Mindre variationer i FLIPS protokollen kan øge sin ansøgning. For eksempel, ændringer i primer sekvenser kan tillade forskellige og flere HIV-1 undertyper skal forstærkes og sekventeret. Sekventering af plasma HIV-1 virioner er muligt gennem tilsætning af cDNA syntese før indlejrede PCR. Fremtidige udnyttelse af enkelt molekyle sekventering metoder vil fjerne behovet for de novo forsamling.
Genetiske sekventering af integrerede HIV-1 provirus har øget vores forståelse af latent HIV-1 reservoiret. VIPPER er et vigtigt redskab for fremtidige undersøgelser belyse sammensætning og fordeling af den latente reservoir. Dog kan anvendelse af FLIPS overskride reservoiret. Fremtidige studier kan udnytte vipper for at fastlægge særlige mål for CRISPR-Cas teknologi, eller bistå med identificering af kodning og ikke-kodende regioner, som gør virussen mere lydhøre over for ventetid vende agenter. Viral rekombination kan blive bedre forstået ved at se på krydset steder af store interne sletninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet Delaney AIDS forskning Enterprise (turde) at finde en kur (1U19AI096109 og 1UM1AI126611-01); en amfAR forskningskonsortium på HIV udryddelse (ARCHE) kollaborative forskning tilskud fra The Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australske Center for HIV og Hepatitis virologi forskning (ACH2); UCSF-GIVI Center for AIDS Research (P30 AI027763); og den australske National sundhed og Medical Research Council (AAP1061681). Vi vil gerne takke Dr. Joey Lai, genomforskning Facility Manager på Westmead Institut for medicinalforskning for hans uddannelse i biblioteket forberedelse og brug af sin facilitet og Ramaciotti Center for genomforskning (University i New South Wales, Sydney, Australien) for at gennemføre sekvensering. Vi accepterer med taknemmelighed de deltagere, der donerede prøver for denne undersøgelse.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |