Fullängds enskilda proviral sekvensering (VOLTER) ger en effektiv och hög genomströmning metod för förstärkning och sekvensering av singel, nära fullängds (intakt och defekta) HIV-1-proviruses och möjliggör bestämning av deras potential replikering-kompetensen. FLIPS övervinner begränsningarna i tidigare analyser för att sekvensera reservoaren latent HIV-1.
Fullängds enskilda Proviral sekvensering (VOLTER) analysen är en effektiv och hög genomströmning metod som syftar till att förstärka och sekvens singel, nära fullängds (intakt och defekt), HIV-1 proviruses. FLIPS tillåter bestämning av den genetiska sammansättningen av integrerad HIV-1 inom en cell befolkning. Genom att identifiera defekter inom HIV-1 proviral sekvenser som uppstår under omvänd Transkription, såsom stora interna borttagningar, skadliga stop kodon/hypermutation, frameshift mutationer och mutationer/borttagningar i cis agerar element krävs för virion mognad, kan VOLTER identifiera integrerade proviruses oförmögna att replikering. FLIPS analysen kan användas för att identifiera HIV-1-proviruses som saknar dessa defekter och är därför potentiellt replikering-behöriga. FLIPS protokollet innebär: lys av HIV-1 infekterade celler, nästlade PCR av nära fullängds HIV-1 proviruses (använda primers riktade till HIV-1 5′ och 3′ LTR), DNA-rening och kvantifiering, bibliotek förberedelse för nästa generation Sequencing (NGS), NGS, de novo montering av proviral contigs, och en enkel process för eliminering för att identifiera replikering-behöriga proviruses. FLIPS ger fördelar jämfört med traditionella metoder avsedda att sekvensen integrerade HIV-1 proviruses, såsom enda-proviral-sekvensering. FLIPS förstärker sekvenser nära fullängds proviruses aktivera replikering kompetensen att vara beslutsamma och använder också färre förstärkning primers, förebygga följderna av primer mismatches. VOLTER är ett användbart verktyg för att förstå genetiska landskap av integrerade HIV-1 proviruses, särskilt inom latent reservoaren, dock kapacitetsutnyttjande kan förlänga för alla program där den genetiska sammansättningen av integrerad HIV-1 krävs.
Genetisk karakterisering av den latenta HIV-1-behållare, som framhärdar i individer på långsiktiga antiretroviral terapi (ART), har varit avgörande för förståelsen att majoriteten av integrerade proviruses är defekta och replikering-inkompetent1 , 2. under processen för omvänd Transkription, fel införs i den integrera proviral sekvensen. Några mekanismer som genererar defekta proviral sekvenser inkluderar den felbenägna HIV-1 omvänt transkriptas enzym3, mallen byta4och/eller APOBEC-inducerad hypermutation5,6. Två nya studier har funnit att cirka 5% av HIV-1 proviruses isolerade från individer på långsiktiga konst är genetiskt intakt, och potentiellt replikering-behöriga, och kan bidra till den snabba uppgången i HIV-1 plasmanivåerna vid upphörande av konst 1 , 2 , 7. tidigare studier har identifierat att replikering-behöriga HIV-1 proviruses kvarstår i naiva och vilande minne CD4+ T cell undergrupper (inklusive central, övergångsbestämmelser och effektor T-minnesceller), om vikten av inriktning på dessa celler i framtiden utrotning strategier2,8,9.
Tidiga insikter i distribution, dynamik och underhåll av reservoaren latent HIV-1 uppnåddes genom utnyttjande av single-proviral (SPS) sekvenseringsmetoder som genetiskt kännetecknar sub-genomisk regioner av HIV-1 genome10 ,11,12,13. SPS är ett mångsidigt verktyg, kunna sekvensera en enda HIV-1 provirus från inom en infekterad cell. SPS är dock inte att avgöra replikering-kompetensen av proviruses, eftersom det bara sekvenser sub-genomisk regioner och missar proviruses som innehåller stora borttagningar inom primer bindningsställen. En tidigare studie visat att SPS överskattar storleken på reservoaren replikering-behöriga av 13 – till 17 – faldigt genom selektivt sekvensering intakt sub-genomisk regioner2.
Att ta itu med begränsningarna av SPS, Ho et al. 4 och Bruner o.a. 1 utvecklade analyser sekvens nära fullängds HIV-1 proviruses. Detta tillät frekvensen av genetiskt intakt, och potentiellt replikering-behöriga, HIV-1-proviruses hos individer på långsiktig ART skall fastställas. Dessa analyser förstärks och sekvenserade (via Sanger sekvensering) sub-genomisk regioner som monterades sedan för att få en sekvens av (intakt eller defekta) HIV-1 provirus. Tre begränsningarna med denna metod är: (1) användningen av flera sekvensering grundfärger ökar risken för oavsiktligt introducera defekter i proviral sekvensen, 2) primer missmatchningar kan förebygga amplifiering av särskild proviruses, och 3) ofta den hela proviral sekvensen inte kan lösas på grund av teknikalitet av dessa metoder.
För att övervinna begränsningarna av befintliga fullängds HIV-1 proviral sekvensering analyser, utvecklat vi Full –Lpåtagning jagindividuella Proviral Sequencing (VOLTER) analysen. VOLTER är en nästa generations sekvensering (NGS)-baserat test som förstärker och sekvenser nära fullängds (intakt eller defekta) HIV-1-proviruses på en hög genomströmning och effektivt sätt. FLIPS ger fördelar jämfört med tidigare analyser, eftersom den begränsar antalet primers utnyttjas; Därför, det minskar risken för primer skillnader, vilket kan begränsa befolkningen av proviruses fångas eller oavsiktligt introducera defekter i en viral sekvens. VOLTER är också mindre tekniskt utmanande än tidigare analyser och omfattar 6 huvudsakliga steg: 1) lys av HIV-1 infekterade celler, 2) förstärkning av enstaka HIV-1 proviruses via nästlade PCR utfört begränsa utspädning med primers som är specifika för den mycket bevarat HIV-1 5′ och 3′ U5 LTR region (figur 1A), 3) rening och kvantifiering av förstärkta produkter, 4) bibliotek beredning av förstärkt proviruses för NGS, 5) NGS, och 6) de novo montering av sekvenserade proviruses att få contigs av varje enskilda provirus.
Sekvenser som genereras av VOLTER kan genomgå en stränga eliminering att identifiera de som är genetiskt intakt och potentiellt replikering-behöriga (figur 1 c)2. Genetiskt intakt proviruses saknar alla kända defekter som resulterar i generation av en replikering-inkompetent provirus. Dessa defekter inkluderar: inversion sekvenser, stora interna borttagningar, hypermutation/skadliga stop kodon, bassubstitutioner eller mutationer i de 5′ förpackning signalen eller större skarva givare (MSD) webbplats.
Figur 1: kritiska steg i fullängds enskilda proviral sekvensering (VOLTER) analysen. (A) HIV-1 DNA-genomet med primer bindningsställen i 5′ och 3′ U5 LTR regioner används av VOLTER för att förstärka nära fullängds (defekt och intakt) HIV-1 proviruses via nästlade PCR. (B) Layout av en PCR-plattan med 96 brunnar innehållande 80 prov wells (20 brunnar för varje spädning), 4 negativa kontrollbrunnar och 1 positiv kontroll väl. (C) process för eliminering används för att identifiera genetiskt intakt, och potentiellt replikering-behöriga, HIV-1-proviruses. Denna siffra har ändrats från Hiener et al. 2 . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
FLIPS analysen är en effektiv och hög genomströmning metod för förstärkande och sekvensering singel, nära fullängds HIV-1 proviruses. Flera faktorer och kritiska steg i protokollet som påverkar antalet och kvaliteten på de sekvenser som erhållits har identifierats. För det första påverka antalet celler och HIV-1 infektion frekvensen av cell befolkningen antalet proviruses förstärks. Till exempel i en tidigare publikation, ungefär hälften så många sekvenser erhölls från samma antal naiva CD4+ T celler jämfört effektor minne CD4+ T celler. Detta beror på att naiva celler har normalt en lägre infektion frekvens än effektor minne celler2. För det andra, cellys är att föredra framför kolumnbaserade extraktionsmetoder för att erhålla genomiskt DNA som det finns ingen risk att förlora DNA i utvinningsprocessen. Slutligen, som med någon PCR-baserat test, förhindrar kontaminering är kritisk. Avskilda rena områden bör utses för att förbereda master mixer, hantering genomiskt DNA, lägga till positiva kontroller, DNA-rening och kvantifiering och bibliotek förberedelse. Detta är särskilt viktigt för singel-kopia analyser som presenteras här.
Genomförandet av VOLTER analysen bör först omfatta kör en positiv kontroll såsom pNL4-3 plasmider snarare än deltagare prover. Detta gör att någon felsökning före användning av HIV-1-positiva celler, som de sekvenser som erhålls kan jämföras med tillgängliga referens sekvenser för dessa plasmider. När du använder HIV-1-positiva celler, är det viktigt att överväga undertypen HIV-1 (primer avsedd för VOLTER är specifika för subtyp B) och infektion frekvensen av cell befolkningen om lite att ingen proviruses förstärks. Primer sekvenser kan vara modified/omgjorda att matcha andra undertyper. Dessutom bör en brunn innehållande en positiv kontroll ingå i varje PCR utförs.
VOLTER har övervunnit begränsningarna av tidigare sekvensering analyser, inklusive SPS. Genom förstärkande och sekvensering nära fullängds HIV-1 proviruses, kan VOLTER bestämma potentiella replikering-kompetensen av HIV-1 proviruses. Detta var inte möjligt med SPS, som sekvenserade bara sub-genomisk regioner och därför valt för sekvenser med intakt primer bindningsställen. Dessutom vänder övervinner begränsningarna med att använda flera amplifiering och sekvensering grundfärger, som var anställd av föregående fullängds sekvensering analyser1,4. Genom två rundor av PCR inriktning Regionkommittén HIV-1 LTR kombinerat med NGS, VOLTER minskar antalet och komplexiteten av primers som krävs. VOLTER är därför mindre känsliga för konsekvenserna av primer missmatchningar, nämligen felaktig identifiering av defekta proviruses och en oförmåga att förstärka vissa proviruses inom en befolkning. FLIPS protokollet är också effektivare och möjliggör en högre genomströmning av sekvensering än tidigare metoder.
Uppenbarligen, VOLTER ger fördelar jämfört med befintliga metoder som bestämmer den genetiska sammansättningen av HIV-1 proviruses. Det är dock viktigt att erkänna begränsningar av VOLTER. För det första har FLIPS analysen inte utvecklats som ett verktyg för att mäta storleken på reservoaren latent HIV-1, som analyser för att fastställa huruvida FLIPS förstärker varje HIV-1 provirus närvarande i en cell befolkning inte har slutförts. FLIPS används istället för att göra relativa jämförelser av sammansättningen av reservoaren mellan olika cell populationer2. För det andra, replikering-kompetensen av intakt HIV-1 proviruses kan inte fastställas med säkerhet utan i vivo analyser, såsom dem som utförs av Ho et al. 4. för det tredje, VOLTER är inte avsedd att fastställa webbplatsens integration i HIV-1 proviruses.
Mindre variationer i VOLTER protokollet kan öka dess tillämpning. Till exempel förändringar i primer sekvenser kan tillåta olika och flera HIV-1 subtyper förstärks och sekvenserade. Sekvensering av plasma HIV-1 virioner är möjligt genom tillägg av cDNA syntes före nästlade PCR. Framtida utnyttjande av enda molekyl sekvenseringsmetoder kommer att eliminera behovet för de novo församling.
Genetisk sekvensering av integrerade HIV-1 proviruses har ökat vår förståelse av den latenta HIV-1-reservoaren. VOLTER är ett viktigt verktyg för framtida studier belysa sammansättning och fördelning av latent reservoaren. Dock kan tillämpningen av VOLTER sträcka sig bortom reservoaren. Framtida studier kan utnyttja VOLTER för att fastställa särskilda mål för CRISPR-Cas-teknologi, eller bistå vid identifieringen av kodning och icke-kodande regioner som göra viruset mer lyhörd för latens backning agenter. Viral rekombination kan förstås bättre genom att titta på korsningen platser av stor inre strykningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes Delaney AIDS forskning Enterprise (vågar) hitta ett botemedel (1U19AI096109 och 1UM1AI126611-01); ett amfAR forskningskonsortiet på HIV utrotning (ARCHE) Collaborative forskningsbidrag från Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Australiska centrum för HIV och hepatit virologi forskning (ACH2); UCSF-GIVI centrum för AIDS-forskning (P30 AI027763); Australiensiska nationella hälsa och medicinska forskningsrådet (AAP1061681). Vi vill tacka Dr Joey Lai, genomik fastighetschef på Westmead Institutet för medicinsk forskning för sin utbildning i biblioteket förberedelse och användning av sin anläggning och Ramaciotti centrum för genomik (University of New South Wales, Sydney, Australien) för att bedriva sekvensering. Vi bekräftar med tacksamhet deltagarna som donerade prover för denna studie.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |