مقايسة ضوئية لإعادة التدوير حويصلة متشابك في الخلايا العصبية مثقف Overexpressing البروتينات Presynaptic
Summary
يصف لنا فحص بصري لحويصلة متشابك (SV) إعادة التدوير في استزراع الخلايا العصبية. الجمع بين هذا البروتوكول مع تعداء مزدوجة للتعبير عن علامة presynaptic والبروتين من الفائدة يسمح لنا بتحديد مواقع presynaptic، حويصلة متشابك على إعادة تدوير القدرات، وتحديد دور بروتين الفائدة.
Abstract
في المحطات الطرفية النشطة الأعصاب presynaptic، حويصلات متشابك الخضوع لدورات أكسو-والالتقام. أثناء إعادة التدوير، أصبح عرضه المجالات لومينال SV transmembrane البروتينات على سطح الخلية. واحدة من هذه البروتينات هو سينابتوتاجمين-1 (Syt1). يتم أخذ جسم مضاد ضد المجال لومينال من Syt1، مرة واحدة إضافة إلى متوسط الثقافة، خلال دورة أكسو-اندوسيتوتيك. هذا الإقبال متناسباً مع مقدار SV إعادة التدوير ويمكن قياسها كمياً عن طريق الفلورة. هنا، نجمع امتصاص جسم Syt1 مع مزدوجة تعداء الخلايا العصبية هيبوكامبال المستزرعة. وهذا يسمح لنا أن (1) ترجمة مواقع presynaptic استناداً إلى التعبير عن علامة presynaptic المؤتلف سينابتوفيسين و (2) تحديد الوظائف الخاصة بهم باستخدام الامتصاص Syt1 (3) تميز استهداف وآثار من البروتين ذات الاهتمام، والتجارة والنقل-روجدي.
Introduction
تدرس إعادة التدوير حويصلة متشابك مهم في تحديد كيفية تغيير خصائص presynaptic، أثناء اللدونة متشابك أو استجابة لاضطراب وظيفة متشابك. دراسة سينابتوتاجمين-1 (Syt1) امتصاص جسم يوفر أسلوب واحد لقياس مقدار SV إعادة التدوير. Syt1 هو بروتين SV المرتبطة بمثابة Ca2 + أجهزة استشعار وضروري لإطلاق سراح اكسوسيتوتيك العصبي1،2. بروتين ترانسميمبراني مع مجال هيولى ج-طرفية خارج SV ومجال لومينال الطرفي ن داخل ال SV3. خلال الرقابة، يصبح مكشوف المجال لومينال من Syt1 إلى الوسط الخارجي. علينا أن نضيف إلى هذه الوسيلة الخارجية، الأجسام المضادة الموجهة ضد المجال هيولى، الذي يصبح استيعابه خلال الالتقام. هذه الأجسام المضادة يمكن أن تكون أما قبل مترافق مع فلوروفوريس أو إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة الثانوية4،5،،من67. كثافة الأسفار إيمونوسيجنال الناتج متناسباً مع مقدار التدوير SV. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد SV التأسيسي والناجمة عن ديبولاريزيشن إعادة تدوير6،8.
يمكن إجراء فحوصات امتصاص Syt1 بعد نقل الفيروس بوساطة الجينات إلى الخلايا جميعها تقريبا في الطبق أو بعد تعداء متفرق من عدد صغير من الخلايا. لدينا أسلوب يجمع بين المقايسة تعداء مزدوجة متفرق من الخلايا العصبية هيبوكامبال الأولية باستخدام فوسفات الكالسيوم9. نحن نستخدم علامة المؤتلف بروتين المعروف أن تتراكم في presynapses، سينابتوفيسين فلوريسسينتلي الموسومة، لتحديد مواقع محطات presynaptic وأوفيريكسبريس لدينا بروتين الفائدة، روجدي. وهذا يسمح لنا لاختبار أم لا روجدي الأهداف الوظيفية synapses، ويؤثر SV إعادة التدوير. تم تحديد الجينات ترميز روجدي أصلاً في شاشة لطفرات المورفولوجية التي تتميز بضعف الذاكرة10. في البشر، وتسبب طفرات في الجينات روجدي مرض نادر ومدمر يسمى متلازمة Kohlschütter-Tönz. المرضى الذين يعانون من تشوهات مينا الأسنان والصرع فارماكوريسيستانت والتأخر الحركي؛ ومع ذلك، ظلت التعريب سوبسيلولار المنتج الجيني بعيد المنال11. وهكذا، تقدم مقايسة الامتصاص Syt1 أدلة أساسية لإضفاء الطابع المحلي على روجدي معلم بروتينات فلورية خضراء في نهايات الفنية9.
هذا الأسلوب امتصاص له فوائد عدة. أولاً، إعادة تدوير SV يمكن ملاحظة في الوقت الحقيقي على حد سواء عن طريق إجراء تصوير لايف7،12، وبعد تثبيت6،9 بقياس كثافة fluorescence تسمية الأسفار Syt1. بالإضافة إلى ذلك، وضعت عدة متغيرات جسم Syt1. وهناك متغيرات غير المميزة التي يمكن تسميتها بجسم ثانوية بعد تثبيت بروتوكول قياسي immunostaining، والمتغيرات قبل مترافق مع تسمية الأسفار تعلق بالفعل. وأخيراً، fluorescence المستندة إلى جسم مفيد بسبب مجموعة كبيرة من الأصباغ الثانوية أو مترافق المتاحة تجارياً التي يمكن استخدامها.
عند تحديد وإيمونوستينينج الخلايا العصبية، من الممكن أيضا وصمة عار للبروتينات إضافية وإجراء تحليل كولوكاليزيشن. هذا يمكن أن يساعد في تحديد مكان تواجدهم فيما يتعلق بإعادة تدوير SVs. كثافة تسمية الأسفار هو التدبير المباشر لمقدار SV إعادة التدوير. وباﻹضافة إلى ذلك، تسمية الأجسام المضادة بشكل انتقائي الهياكل التي تحتوي على Syt1، مما أدى إلى خصوصية عالية والقليل من الأسفار الخلفية4. يمكن أيضا استخدام البروتوكولات التحفيز المختلفة، مثل المخازن المؤقتة depolarization أو التحفيز الكهربائي البروتوكولات9،12،،من1314. ومع ذلك، يمكن قياس تدوير SV القاعدية دون تنشيط الثقافات العصبية15.
لدينا أسلوب يتناول تحديداً امتصاص جسم Syt1 في الخلايا العصبية transfected مزدوجة مع الأجسام المضادة الثانوية إيمونولابيلينج بعد التثبيت. ومع ذلك، نشير إلى كافة المتغيرات المستخدمة بصورة روتينية للمقايسة في مناقشتنا لإعطاء المشاهدين فرصة للتكيف مع البروتوكول للاحتياجات المحددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك ثلاثة فحوصات استخدامها بشكل روتيني لدراسة متشابك حويصلة (SV) إعادة التدوير. الأول والثاني وتشمل الاستخدام) ستيريل الفلورية الأصباغ مثل FM1-43 (والتي تدرج في الأغشية ويتم تناولها في العضيات أثناء الالتقام، وتم إصدارها بعد الرقابة)؛ وب) فلوريسسينتلي معلم المؤتلف البروتينات SV (التي، عند أ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ارمغارد فايس لخبراء المساعدة التقنية. وأيد هذا العمل DFG عبر الكتلة التميز للفحص المجهري في نطاق نانومتر والفيزيولوجيا الجزيئية للمخ (كنمبب، B1-7، إلى T.D.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
Riferimenti
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
