Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques
Summary
Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.
Abstract
À terminaisons nerveuses présynaptiques actives, les vésicules synaptiques subissent des cycles d’exo – et l’endocytose. Lors du recyclage, les domaines luminales de protéines transmembranaires SV deviennent exposés à la surface cellulaire. Une de ces protéines est synaptotagmine-1 (Syt1). Un anticorps dirigé contre le domaine luminal de Syt1, une fois ajoutée au milieu de culture, est repris pendant le cycle exo-endocytose. Cette absorption est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV et peut être quantifiée par immunofluorescence. Ici, nous combinons l’absorption anticorps Syt1 avec double transfection des neurones hippocampal cultivés. Cela permet de nous (1) localiser les sites présynaptiques basées sur l’expression du marqueur présynaptique recombinant synaptophysine, (2) déterminer leurs fonctionnalités à l’aide de l’absorption Syt1 et (3) caractérisent le ciblage et les effets d’une protéine d’intérêt, GFP-Rogdi.
Introduction
Étudier le recyclage de la vésicule synaptique est importante pour déterminer comment les propriétés présynaptiques changent, soit au cours de la plasticité synaptique, ou en réponse à la perturbation de la fonction synaptique. Étudier la synaptotagmine-1 (Syt1) absorption anticorps fournit une méthode de mesure de la quantité de recyclage de la SV. SYT1 est une protéine associée aux SV qui agit comme un capteur de Ca2 + et est nécessaire pour la libération du neurotransmetteur1,2exocytotique. C’est une protéine transmembranaire avec un domaine cytoplasmique C-terminal en dehors de la SV et un domaine luminal N-terminal à l’intérieur de la SV3. Au cours de l’exocytose, le domaine luminal de Syt1 devient exposé au milieu externe. Dans ce milieu externe, nous ajoutons des anticorps dirigés contre le domaine cytoplasmique, qui devient intériorisé au cours de l’endocytose. Ces anticorps peuvent être que soit des conjugués avec fluorophores ou immunomarquage avec anticorps secondaires4,5,6,7. L’intensité de la fluorescence de l’immunosignal qui en résulte est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV. Cette approche peut servir à déterminer la SV constitutive et induite par une dépolarisation recyclage6,8.
Essais de captation SYT1 peuvent être effectuées après le transfert de gène induite par le virus à presque toutes les cellules dans le plat ou après transfection clairsemée d’un petit nombre de cellules. Notre méthode allie l’analyse clairsemée double transfection des neurones de l’hippocampe primaires à l’aide de phosphate de calcium9. Nous utilisons une protéine recombinante marqueur connue pour s’accumuler à presynapses, synaptophysine fluorescent étiqueté, pour localiser les terminaisons présynaptiques et surexpriment notre protéine d’intérêt, Rogdi. Cela nous permet de tester si oui ou non Rogdi objectifs fonctionnels synapses et affecte SV recyclage. Le gène codant pour la Rogdi a été initialement identifié dans un écran pour des mutants de Drosophila caractérisées par des troubles de la mémoire10. Chez l’homme, des mutations du gène Rogdi causent une maladie rare et dévastatrice appelée syndrome de Kohlschütter-Tönz. Les patients souffrent de malformations de l’émail dentaire, l’épilepsie pharmacorésistantes et des retards psychomoteurs ; Cependant, la localisation subcellulaire du produit du gène est resté insaisissable11. Ainsi, l’essai d’absorption Syt1 fourni des éléments de preuve fondamentaux pour la localisation de GFP-étiquetée Rogdi à synapses fonctionnelles9.
Cette technique d’absorption a plusieurs avantages. Tout d’abord, SV recyclage peut être observée aussi bien en temps réel en effectuant le live d’imagerie7,12et après fixation6,9 en mesurant l’intensité de la fluorescence de l’étiquette de fluorescence Syt1. En outre, plusieurs variantes d’anticorps Syt1 ont été développés. Il y a des variantes sans étiquette qui peuvent être marqués avec un anticorps secondaire suite à un protocole standard immunostaining après fixation et variantes des conjugués avec une étiquette de fluorescence déjà fixée. Enfin, la fluorescence à base d’anticorps est avantageuse en raison de la grande sélection de disponible dans le commerce secondaires ou conjugués des colorants qui peuvent être utilisés.
Lorsque fixation et immunostaining les neurones, il est également possible souiller des protéines supplémentaires et effectuer des analyses de colocalisation. Cela peut aider à déterminer où ils se trouvent en ce qui concerne le recyclage SVs. L’intensité de l’étiquette de fluorescence est la mesure directe de la quantité de SV recyclage. En outre, les anticorps étiquette sélectivement les structures contenant Syt1, ayant pour résultat une spécificité élevée et peu de fluorescence de fond4. Protocoles de stimulation différents permet également, tels que les tampons de dépolarisation ou protocoles de stimulation électrique9,12,13,14. Toutefois, les basales SV recyclage peut être mesurée sans stimuler les cultures de neurones15.
Notre méthode s’adresse spécifiquement Syt1 absorption d’anticorps dans les neurones double transfectées avec l’anticorps secondaire immunomarquage après fixation. Cependant, nous nous référons à toutes les variantes utilisées systématiquement du dosage dans notre discussion pour donner aux téléspectateurs l’occasion d’adapter le protocole à des besoins spécifiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a trois tests couramment utilisées pour étudier les vésicules synaptiques (SV) recyclage. Les deux premiers comprennent l’utilisation d’un) styryl fluorescente colorants comme FM1-43 (qui incorporent dans les membranes et sont repris dans les organites au cours de l’endocytose sont libérés après exocytose) ; et b) fluorescent tag protéines recombinantes de SV (qui, à la surexpression, incorporent dans la machinerie protéique de recyclage). Si les fluorophores attachés changer leur fluorescence selon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Irmgard Weiss d’assistance technique d’experts. Ce travail a été soutenu par la DFG via le pôle d’excellence pour la microscopie à la gamme nanomètre et physiologie moléculaire du cerveau (CNMPB, B1-7, à T.D.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
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