İntravenöz ve içi amniyotik rahim içinde nakli fare modeli
Summary
Biz bir rahim içinde nakli (IUT) intravenöz ve içi amniyotik yolları enjeksiyon fare modeli gerçekleştirmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı hücreleri, viral vektörel çizimler ve diğer maddelerin benzersiz bağışıklık dayanıklı fetal ortama tanıtmak için kullanılabilir.
Abstract
Rahim içinde nakli (IUT) kök hücreler, viral vektörler veya herhangi bir diğer maddeler erken gebelik tanıtmak için kullanılan terapi, benzersiz ve çok yönlü bir modudur. IUT arkasındaki mantığı için tedavi amacıyla fetus, fetal immünolojik gelişmemişlik, erişilebilirlik ve cenin kök veya progenitör hücre ve bir hastalığı tedavi etmek için potansiyel proliferatif doğa veya belirtilerin başlangıcı küçük boyutuna göre Doğum öncesinde. Fetus, hematopoetik kök hücre (HSC) yolu ile gösterimi bu normal gelişim özelliklerini yararlanarak bir IUT gerekli olmadan orak hücre hastalığı gibi konjenital hematolojik bozuklukları tedavi potansiyeline sahiptir myeloablative veya immünsüpresif Klima postnatal HSC nakli için gerekli. Benzer şekilde, birden çok organlarda progenitör hücrelerin erişilebilirlik geliştirme sırasında potansiyel bir daha verimli bir gen tedavisi veya genom düzenleme viral vektörler IUT takip kök/progenitor hücre hedefleme için sağlar. Ayrıca, IUT olabilir de dahil olmak üzere normal gelişim süreçleri çalışırdım, ama immünolojik tolerans gelişimi için sınırlı değildir. Fare modeli potansiyeli ve önceden klinik büyük hayvan çalışmaları ve nihai bir klinik uygulama öncesinde IUT sınırlamaları anlamak için değerli ve uygun bir yol sağlar. Burada, intravenöz ve içi amniyotik yolları fare fetus bir IUT gerçekleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı gerekli koşullar ve mekanizmaları rahim içinde hematopoetik kök hücre transplantasyonu, hoşgörü indüksiyon ve rahim içinde gen terapisi arkasında aydınlatmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.
Introduction
Son gelişmeler antenatal tarama ve tanı fetus yeterli Doğum sonrası tedavi seçenekleri var ve önemli morbidite ve mortalite neden konjenital bozukluklar bir dizi tedavi imkanı ışık için getirdim. Özellikle, rahim içinde hematopoetik kök hücre transplantasyonu (IUHCT) ve gen terapisi/genom düzenleme hematolojik, bağışıklık ve genetik konjenital tedavisinde fetusun normal gelişim özelliklerinin avantajlarından yararlanın potansiyeline sahip daha verimli postnatal HSC nakli ve tedavi/Genom Gen düzenleme1,2yapabilirsiniz daha bozuklukları. Özellikle, fetus küçük boyutu nedeniyle, donör hücre veya viral vektör doz alıcı kilo maksimize. Ayrıca, fetusun immünolojik gelişmemişlik donör myeloablative ve immünsupresif Klima enjekte edilir HSCs Doğum sonrası organ nakli Protokoller’de gereklidir sağlar. Benzer şekilde, bir terapötik transgene ya da genom düzenleme teknoloji taşıyan viral vektörler transgene ürün ya da viral vektör bir sınırlayıcı bağışıklık yanıtı olmadan enjekte edilebilir. Son olarak, erişilebilirlik ve cenin kök/progenitor hücre proliferatif doğa Bisiklete binme gerektiren belirli modları genom düzenleme (Homoloji yönetmen onarım) yanı sıra hedef progenitör hücrelerin daha verimli bir iletim olasılığını göze verimli bir şekilde gerçekleşmesi için hücreleri. Fare modeli kök hücre biyolojisi ve İmmünoloji önceden klinik büyük hayvan modellerinde deneme önce önemli soruları ele için anlayışlı ve uygun fiyatlı bir araç olarak hizmet vermektedir ve bu nedenle, hangi IUHCT ve rahimde birincil model olarak hizmet vermiştir gen terapisi keşfedilmeyi1,2,3olmuştur.
Her ne kadar fazla değişken IUHCT ve rahim içinde gen terapisi/genom fare ve büyük hayvan modellerinde düzenleme başarısında önemli bir rol oynamaktadır, bir anahtar değişken teslim HSCs veya viral vektör yöntemidir. Donör HSCs fetal karaciğer, hematopoetik organ IUHCT, zaman içinde meydana gelen bir ilk geçiş etkisi ile yüksek dozda teslimini engraftment fare ve büyük hayvan modeller4 macrochimeric düzeyleri ulaşmada vesile olmak için gösterilen ,5. Bu elde ile donör hücreleri ile fare modeli vitelline ven ve üzerinden intra kardiyak iğne köpek modelindeki bir enjeksiyon yapıldı. Rota enjeksiyon de progenitör hücrelerin farklı organların gelişimi sırasında hedefleme temel bir rol oynar. Örneğin, bir İntravenöz enjeksiyon yolu ile vitelline ven verimli bir şekilde cardiomyocytes ve geç gebelik enjeksiyon6,7takip tetkikine transduce gösterilmiştir. Alternatif olarak, fiziksel olarak sunulan organları enjeksiyon8sırasında embriyonik katlanır/geliştirme üzerinde temel hedefleme viral vektörler içi amniyotik bir enjeksiyon sağlar. Bu en iyi solunum epitel ile gebelikte hangi amniyon içinde viral vektör için solunum yolu sunar “nefes” normal cenin hareketleri yararlanmak için geç içi amniyotik bir enjeksiyon hedefleyerek örneklenir sıvı9. Bu iki işletim modundan birinde IUT, intravenöz üzerinden vitelline ven ve içi amniyotik, birden çok geçmiş ve devam eden bizim laboratuvar deneylerinde temeli olmuştur. Bu protokol için biz Intravenöz ve içi amniyotik IUT fare modelinde gerçekleştirmek için yöntem ayrıntılı olarak tarif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rahim içinde nakli erken gebelik tanısı birçok konjenital bozukluklar için potansiyel bir tedavi yöntemidir. Fare modeli IUT için araştırmacılar fetal çevre keşfetmek için veya farklı terapileri ile deneme için izin verir. Ne enjekte edilir ve ne hedef bağlı olarak, intravenöz veya içi amniyotik rahim içinde nakli bir injectant bir güvenilir teslim istenen alanı içine sağlayabilir.
Belirli organ hedef olarak gösterirken, fetus yanı sıra enjeksiyon t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Riferimenti
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
