Summary
Burada kollarındaki kullandığımız, x-ışını nasıl inhibe mTOR etkinlik çalışmaya ve pozitron emisyon tomografi/bilgisayarlı tomografi Imaging etkileri myeloma kemik iliği engrafted tümörler bir xenograft modeli. Bu myeloma kemik iliği engrafted tümör vivo içindehedefleme terapiler Anti-miyelom etkisini fizyolojik ilgili, non-invaziv ve multimodal analizleri için sağlar.
Abstract
Multipl Miyelom (MM) tümörler kemik iliği (BM) engraft ve onların hayatta kalma ve ilerleme içinde bu microenvironment var karmaşık moleküler ve hücresel etkileşimlerin üzerine bağlıdır. Henüz BM microenvironment potansiyel olarak birçok vitro ve ex vivo deneysel model fizyolojik alaka sınırlayan kolayca çoğaltılmış vitro, olamaz. Hangi luciferase (LUC) xenograft modelinde kullanarak bu sorunları üstesinden gelebilir-transfected 8226 MM hücreleri özellikle fare iskeleti engraft. Bu fareler uygun substrat verildiğinde, D-biyoluminesans, tümör büyüme ve hayatta kalma tedavisinin etkileri tümörleri içinde vivotarafından üretilen kollarındaki görüntüleri (BLI) değişiklikleri ölçerek analiz edilebilir. Bu BLI veri metabolik işaretçisi 2 kullanarak pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi (PET/CT) analizi ile kombine-deoksi - 2-(18F) fluoro-D-glukoz (18F-FDG) tümör metabolizma zaman içinde değişiklikleri izlemek için kullanılır. Tümör/BM microenvironment içinde birden çok invaziv olmayan ölçümler için görüntüleme bu platformlar sağlar.
Introduction
MM malign plazma B-hücreleri BM sızmak ve kemik yıkımı, anemi, böbrek bozukluğu ve enfeksiyon neden oluşur tedavisi olmayan bir hastalıktır. MM ve iskelet2dahil etmek için en sık kanser % 10 - % 15'tüm hematolojik maligniteler1 yapar. Oncogenic dönüşümün lenfoid doku germinal merkezleri sonunda BM3' e homing önce kurulan uzun ömürlü plazma hücrelerinin MM gelişimi kaynaklanmaktadır. BM tarafından son derece heterojen nişler karakterizedir; farklı ve kritik hücresel bileşenleri, düşük pO2 (hipoksi), geniş vaskülarizasyon, karmaşık ekstraselüler matrisler ve tüm bunlar MM tumorgenesis4' e katkıda bulunur, sitokin ve büyüme faktörü ağları da dahil olmak üzere. Böylece, kesinlikle BM engrafted tümörler ile karakterize Dissemine bir MM xenograft model geliştirilmesi MM patoloji vivo içinde5,6eğitim için çok güçlü ve klinik bir araç olacaktır. Ancak, çok sayıda teknik engellerin en xenograft modelleri, yapım onları uygulamak zor ve pahalı etkinliğini sınırlayabilirsiniz. Bu yetenek doğrudan gözlemlemek ve gerek kalmadan değişiklikleri tümör büyüme/hayatta kalma ölçmek için tutarlı ve tekrarlanabilir tümör engraftment tümör gelişimi ve sınırlamalar uzun bir zaman içinde BM niş ile ilgili sorunları içerir Fareler deney7,8ders sırasında kurban.
Bu iletişim kuralı başlangıçta Miyakawa vd tarafından geliştirilen bir değiştirilmiş xenograft modeli kullanır 9içinde bir intravenöz (IV) meydan okuma miyelom hücreleri ile sonuçlanır, "yaygın" tutarlı ve tekrarlanarak NOD/SCID/IL-2γ(null) BM (takoz) fareler10' engraft tümörler. Situ görselleştirme bu tümörlerin 8226 insan MM hücre kültürünü istikrarlı transfection LUC alleli ile elde edilir ve bu engrafted tümör hücreleri6tarafından üretilen seri olarak BLI değişimler ölçme. Önemlisi, bu model çeşitli diğer LUC ifade insan MM hücre satırları (Örneğin, U266 ve OPM2) yararlanmak için özellikle NOG fareler iskeleti engraft için benzer bir eğilimi ile genişletilebilir. Tümör yanında farelerin kollarındaki düşsel tanımlaması (örneğin 18F-FDG) proton probları PET/CT birlikte tarafından alımını ölçerek takip edilir, bu biyokimyasal ek karakterizasyonu kritik için sağlar yolları (yani, metabolizma, hipoksi değişimler ve Apoptozis indüksiyon) tümör/BM microenvironment içinde. Bu model büyük gücü radiolabeled, kollarındaki ve floresan problar ve MM ilerleme ve patoloji içinde vivoeğitim için kullanılan işaretleri geniş kullanılabilirlik tarafından vurgulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm hayvan yordamlar kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) büyük Los Angeles VA sağlık sisteminin tarafından kabul edildi ve patojen ücretsiz ve steril koşullarda gerçekleştirilmiştir.
1. hazırlanması 8226 hücrelerinin (8226-LUC) Luciferase ifade
- İnsan MM hücre kültürünü 8226, % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin % 95 hava ve %5 karbondioksit (CO2) içeren bir oksijen atmosferde 37 ° C'de ile takıma RPMI-1640 ortamda korumak.
- İstikrarlı LUC ifade muhabir 8226 hücreler üretmek transfecting 1 x 10 tarafından açıklanan6 8226 hücrelerinin bir seçim hygromycin (100-350 mg/mL) ile daha önce takip luciferase muhabir vektör ile6.
- Koşullarda orta kadar stabil transfected 8226 hücre kültürünü kurulması oluşturulan her geçen gün değişen standart steril kodlamayla için 2-3 hafta, hücreleri korumak.
- Transfected 1 x 106 hücreler/100 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) in vitro luciferase faaliyette luciferase substrat, D-biyoluminesans ekleyerek onaylamak (150 µg/mL çalışma çözüm prewarmed kültür ortamında) ve ölçme bir tüp veya luminometer6kullanarak 96-şey plaka hücrelerde biyolüminesans.
2. Orthotopic Xenograft modeli
- NOG fareler (4-6 hafta yaşlı, erkek veya kadın) bir uygun hayvan bakımı tesiste steril/patojen-Alerjik koşullarda korumak.
- 8226 LUC transfected hücreleri denemenin gün NOG fareler (~ 5 x 106 hücreler/fare) içine IV enjeksiyon için hazır olun. 3 hücreleri yıkama x buz gibi PBS, onları saymak ve onları buz gibi PBS (eksi antibiyotik ve FBS) içinde 5 x 106 hücreler/200 µL PBS, son bir konsantrasyon resuspend) steril bir test tüpü içinde. Hücreler buz tutmak ve en kısa zamanda (içinde 30-120 dk) fareler zor.
- Fare (ile isoflurane, % 0,5 - 1 L/dak, havada % 1-3) anestezi ve hayvan uzakta karşı karşıya kafa ile bir Isıtma yastık üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Anesthetization ayak parmak pinching tarafından kontrol. Oftalmik merhem gözler için geçerlidir.
- 1 mL insülin şırınga ve 26-G iğne kullanarak 8226-LUC hücrelere fare kuyruğu ven (200 µL/enjeksiyon) yoluyla enjekte.
Not: A ısı lamba böylece damar genişletici ve enjeksiyonları etkinliği artan kuyruk ısıtmak için kullanılabilir. - Hayvan ev onların kafes dönmek ve onlar tamamen iyileşti kadar hayvanları izlemek.
- Engraftment fare iskelet 8226-LUC hücrelerinin (aşağıda açıklanan ve Şekil 1Aile gösterilen) imzalat farelerde BLI ölçerek onaylayın.
Not: BM exudates da insan CD45 ifade akış sitometresi (Şekil 1B) kullanarak veya hasat kemik (Şekil 1 c) immünhistokimya boyanabilen.
3. BLI Vivo içinde ölçümü
Not: Genellikle, ölçülebilir BLI farelerde engrafted tümör gelen ilk 10-20 gün postchallenge arasında görülebilir ancak bu deneysel olarak belirlenecek gerekebilir.
- Fare (ile isoflurane, % 0,5 - 1 L/dak, havada % 1-3) anestezi ve ayak parmak pinching tarafından anesthetization düzeyini kontrol edin. Oftalmik merhem gözleri için geçerlidir.
- Hayvan bir IP (200 µL/enjeksiyon), iğne "in vivo-sınıf" D-biyoluminesans substrat (30 mg/mL steril serum fizyolojik içinde seyreltilmiş).
- (BLI etkinlik observable için 45-60 dakikaya kadar farelerde olmasına rağmen) biyoluminesans substrat enjeksiyon takip BLI 5-10 dakika içinde ölçmek, küçük hayvan görüntüleme sistemi (Şekil 2 sırtüstü pozisyonda imzalat hayvan yerleştirerek ). Işıksaçan ve x-ışını analiz seçin ve görüntüleri (Şekil 3).
- Faiz (ROIs) düşsel bilgisayar yazılımı (Şekil 4) kullanarak seçili bölgelerinde ortalama parlaklık (fotonlar/s/cm2/steradian) ölçmek.
- Hayvan ev onun kafes dönmek ve tam olarak (yaklaşık 15-20 dk) kurtarıldı kadar izlemek.
4. fare hedefe yönelik tedavi ile tedavi
- Temel BLI ölçmek ve hayvanları tedavi gruplara (4-8 fareler/grup) rastgele.
- Fareyi kullanarak beş günlük IP enjeksiyonları dinlenme ve ek beş günlük enjeksiyonları11tarafından 2 gün takip ettim bir rejimi temsirolimus (0.2 - 40 mg/kg fare) bir IP enjeksiyon (200 µL/enjeksiyon) ile tedavi.
- Luciferase aktivite (fotonlar/s/cm2/steradian) ölçmek Bölüm 3 ve arsa BLI değişim zaman içinde açıklandığı gibi haftada 2 x. Tümör değişimler BLI fareler (Şekil 5B) seri görüntü olarak sunulabilir.
Not: Aşağıdaki belirtilerle (genellikle 45-60 gün içinde ilk Challenge) mevcut kadar günlük hayvanların izleme gerçekleştirilmesi önerilir: kilo kaybı (ağırlık implantasyon öncesinde göre % 10'den fazla kayıp) ve/veya hind Kol felci, hangi zamanda servikal çıkığı tarafından takip CO2 odası kullanarak onlar euthanized.
5. PET/BT Analizi 18F-FDG ölçmek tümör metabolizmasında değiştirir.
- Ev onların kafes hayvanlarda onların yiyecek için 24 saat önce 18F-FDG aşırı non-spesifik alımını önlemek için deney kaldırarak hızlı.
- 18FDG PET F radiolabeled sondalar (50-100 steril serum fizyolojik içinde µCi/enjeksiyon) deneme günü hazır olun. Saat ve 18F-FDG soruşturma faaliyetleri ile bir doz Kalibratör kaydedin.
Not: 18F nispeten kısa yarılanma (~ 2 h) olduğundan, dikkatli bir hazırlık ve planlama Bu sondalar kullanım için oluşturulmalıdır. - Hayvanla (isoflurane, % 0,5 - 1 L/dak, havada % 1-3) anestezi ve uzağa bakan kafa ile bir Isıtma yastık üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Anesthetization ayak parmak pinching tarafından kontrol. Oftalmik merhem gözleri için geçerlidir.
- Sonda ile korumalı 1 mL insülin şırınga ve 26-G iğne kullanarak kuyruk ven (100 µL/enjeksiyon) enjekte.
Not: A ısı lamba böylece damar genişletici ve enjeksiyonları etkinliği artan kuyruk ısıtmak için kullanılabilir. - İğne/şırıngada bir doz Kalibratör kalan radyoaktivite ölçmek ve etkinlik ve zamanı not edin.
Not: Fare kuluçka, doz ve zamanlama standardizasyon veri tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir sağlamak için önemlidir. - Anestezi altında ve sonda alımı (~ 45-90 dk) bütün döneminde bir ısıtma yastığını kullanarak 37 ° C'de fareler korumak.
Not: Fareler durgun ve 37 ° C de sonda non-spesifik alımını önlemek için kalır önemlidir. - Aralıklarla benzer etiketleme kez farelerde sağlamak için yaklaşık 20 - 30 dk 18F-FDG sonda enjeksiyonlari bocalama.
Not: Uygun iş akışı ve sonda enjeksiyonları zamanlaması en uygun ve tekrarlanabilir görüntüleme koşullarında neden olur. - 18F-FDG etkinliği bir PET/CT küçük hayvan görüntüleme sistemi seçilen bölgelerde ilgi engrafted tümörler (Şekil 6) karşılık gelen ölçü birimi.
Not: Başlangıçta, 10dk statik evde beslenen hayvan poz ve 2-min CT pozlama tavsiye edilir, ancak tam pozlama süreleri deneysel olarak belirlenecek gerekebilir. - Hayvanlar için ev onların kafes dönmek ve onları tamamen iyileşti kadar izlemek. Arka plan seviyelere sonda bozunmaları ise 24 h için özel bir dönüş Oda farelerde ev.
Not: 18F kısa yarılanma nedeniyle, taze bir sonda kullanarak birden çok ölçüleri haftada 2 x olarak sık sık yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skuamöz MM tümörler kolayca edildi (% 100 başarı oranı) oluşan, ancak ilk pilot çalışmalarda 8226-LUC hücreleri IV enjeksiyonu NOD/SCID fareler içine BM-engrafted MM, geliştirmek tümörler değil. Buna ek olarak, IV zorluklar NOG fareler içine 8226 hücrelerle (15-25 gün içinde) tümör iskelet (ve karaciğer ve dalak gibi sigara-İskelet dokusunda tek nadiren oluşan tümörler) oluşturulur. Tümör iskelet içinde görsel olarak fiziksel olarak hayvanlar inceleyerek onaylanamadı beri başarılı tümör engraftment ve tümör BM (Şekil 1) içinde konumunu doğrulamak için dikkate alınması gereken diğer yöntemleri vardı. Benzer raporları Miyakawa vd. 8226 hücreleri tarafından üretilen 9, insan IgG, ELISA (veri) gösterilmez, kullanarak meydan NOG fareler serum içinde tespit her ne kadar bu veriler yalnızca engraftment değil konum veya tümörlerin ölçüde doğruladı. Birden fazla hayvan seri görüntüleme BM-engrafted MM Tümörleri (Şekil 4) dağılımı gösterir. Bunlar tarafından üretilen BLI tümör hücreleri can engrafted sonra seri olarak ve non-invaziv değişiklikler tümör büyüme ve hayatta kalma mTOR inhibitörü temsirolimus (Şekil 5) ile tedavi farelerde değerlendirmek için ölçülebilir. Son olarak, PET/BT analiz için 18F-FDG tümör'alımını temsirolimus aracılı değişiklikleri glikoz metabolizması ve bu değişiklikleri tümör büyüme (Şekil 6) ile ilişkili göstermek için kullanıldı. Ancak, stabil bir optik görüntüleme/X-x-ray analizi ile birlikte bir luciferase alleli ile 8226 hücrelerinin transfecting tarafından tam konumları ve dağıtım fare iskelet MM tümörlerin hızlı ve non-invaziv tespit edilemedi.
Şekil 1: 8226-LUC engraftment onayı hücreleri fare iskeleti. (A) NOG fareler meydan 5 x 106 8226-LUC2 hücreleri IV (fare sol) veya serum fizyolojik (fare sağ) ile. 15 gün sonra fare D-biyoluminesans substrat bir IP enjeksiyon verildi ve küçük hayvan görüntüleme sistemi kullanarak yansıma. (B) fareler kurban edildi, kemiklerine toplanmıştır ve BM hücresel çıktı hasat. İnsan CD45 ifade PE Birleşik anti-insan CD45 antikor kullanarak akış sitometresi tarafından tespit edilmiştir. (C) Bu panel gösterir bir immünhistokimya seri fare kalça pimonidazole (en iyi panelleri) veya insan CD45 kullanarak hipoksi lekeli bölümden (alt paneller) farelerde 8226 (doğru panelleri) ile meydan veya serum fizyolojik (denetim; sol kapı aynası). Yıldız işareti seri bölümlerde büyük bir kan damarı konumunu gösterir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: imzalat NOG fareler BLI ölçme önce görüntüleme sistemi içinde konumlandırma gösterilen sinyal MM tümörler kemik iliği engrafted. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Set-up optik görüntüleme ve x-ışını analiz kollarındaki sinyal toplanan NOG fareler. Hayvanlar başarıyla meydan var ve BM tümörlerin engraftment onaylamıştır sonra fareler tedavi gruba randomize. Deneme süresince çeşitli zamanlarda, hayvanlar BLI değişimler için izlenebilir. Noninvaziv yöntemdir çünkü izleme frekans ne kadar hızlı bir şekilde kanser hücrelerinin terapiye cevap verecektir de tümörlerin beklenen büyüme yansıtacak şekilde değiştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kemik iliği engrafted MM tümörler dağılımını gösteren birden çok hayvanların seri görüntüleme. Faiz (ROI) her fare için bölgelerinde tanımlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: bir anti-MM tedavi rejimi sırasında NOG farelerde engrafted tümörlerin BLI değişimler. (A) Bu panel temsirolimus (20 mg/kg fare) içinde ortalama parlaklık (p/s/cm2/ser) bir değişiklik gösterir-5 x 106 hücrelerle tedavi NOG fareler meydan IV. Fareler engrafted tümörler için pozitif olarak tespit edildi sonra çeşitli tedavi gruplar halinde randomize. Fareler beş IP enjeksiyonları 2 günlüğüne dinlenmek ve ek bir beş IP enjeksiyonları (x ekseni üzerinde çubuklar gün tedavi gösterir) temsirolimus veya araç kontrolü, sonra ardından günlük, verildi. Çeşitli günlerde fareler IP enjeksiyonlari verildi "içinde vivo-sınıf" D-biyoluminesans ve saçınıza bir optik görüntüleme platformu kullanarak ölçülen. Değerleri ortalama parlaklık (p/s/cm2/ser) ± % 95 güven aralığı temsil eder. (B) bu Kaplan-Meier Arsa hayatta kalan farelerin yüzde olarak zaman içinde değişiklik gösterir. Bitiş noktası kriterleri (yani, > %10 vücut ağırlığı veya hind-felç kaybı) ulaşmıştı fareler insanca euthanized. (C) Bu panel değişiklikleri LUC faaliyet gösteren gün 28, 35 ve 40, alınan farelerin temsilcisi görüntüleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Seri görüntüleme ve PET/CT tarafından 18F-FDG alımını göreli değişiklikleri (A) Bu panel gösterir seri görüntüleme bioluminescence (optik görüntüleme/X-x-ray) görüntüleme ve 18F-FDG PET/CT BLI tarafından alımı için aynı fare imzalat farelerde ölçüldü ve PET/CT görüntüleme aynı fare 24 saat sonra gerçekleştirildi. Fare gecede oruç ve çalışma günü, IV enjeksiyonu 50 µCi 18F-FDG aldı. Fareler sonda alımı kuluçka (60 dk) sırasında anestezi altında muhafaza ve daha sonra 18F-FDG alımı için PET/CT analiz tarafından analiz edildi. Tümörler (T1 ve T2) gösterilir. H kalp, K = böbrek ve B = mesane =. (B) Bu panel denetimi 18F-FDG Anlamazdın göreli değiştiğinde (tedavi edilmemiş kontrol tümörler yüzdesi cinsinden) gösterir fare (tedavi) veya temsirolimus (20 mg/kg fare)-tedavi fareler (22, 35 ve 40 gün cinsinden). Verileri ortalama sunulmaktadır (n = 5 fareler) ± 1 S.D. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Preklinik xenograft modelleri MM6,9,11,12,13çeşitli rağmen BM microenvironment içinde tümör/BM etkileşimleri çalışma yeteneği zor kalır 14. iskelet NOG farelerin 8226-LUC tümör hücrelerinin hızlı ve tekrarlanabilir engraftment için burada açıklanan teknikler sağlar.
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda luciferase ifade MM hücre hatları kurulması ve istikrarlı bir ifade luciferase vitro15doğrulanmasına dahil. Hücre hatları kurduk, NOG fareler IV enjeksiyonu ile meydan okudu ve iskelet için tümörlerin engraftment (genellikle 10-20 gün postchallenge içinde) BLI etkinlik içinde vivo ölçerek onaylandıktan sonra (Şekil 1A). İmmünyetmezligi diğer suşların (örneğin NOD/SCID) genellikle BM engrafted tümör oluşturmaz çünkü NOG fare kullanımı önemlidir. İmplantasyon (> %90) nispeten yüksek başarı oranını olumlu BLI sinyal gözlemlemek için kısa zaman aralığı yapar ve bu model anti-MM tedavi yöntemleri (Şekil 4) yüksek üretilen iş ve boyuna analiz için ideal. Başka bir çok önemli bu model BM-engrafted MM hücre satırları üst hücre hatları (Örneğin, 8226, U266); morfolojik ve immünolojik özellikleri korumak olanıdır Onlar tutarlı ve tekrarlanabilir büyüme modelleri ve özellikleri artan serum insan IgG paraprotein düzeyleri ve kemik lezyonlar oluşumu gibi hasta hastalıkların sergilemek.
Bu strateji sürekli hastalık progresyon ve yanıt olarak anti-tümör tedavi boyunca biyokimyasal ve moleküler bileşenleri tümör/BM microenvironment, eğitim için bu güçlü görüntüleme teknikleri kullanımı avantajdır. Bu deneyde, bulduk mTOR etkinlik farelerde BM engrafted miyelom tümörleri ile hedef zaman içinde gözlenen kollarındaki ölçümleri bir düşüş içinde sonuçlandı. Ayrıca, bu aynı tümör 18F-FDG soruşturma (Şekil 6B) alımını değişimler değişikliklere kollarındaki sinyal (5B rakam) korelasyon bulundu. Başka bir önemli bu yordam birden çok biyokimyasal değişken zaman içinde tümör içinde ölçülebilir bileşenidir. Tümör ilerleme değişiklikler tümör fizyolojisi ve microenvironment özellikleri ile karakterize olan dinamik bir süreç olduğu için bu özellikle önemlidir. Böylece, bu yordam, non-invaziv doğası ve sondalar, nispeten kısa yarılanma nedeniyle tedavi tümör cevaben değişiklikleri birden çok boyuna analiz sağlar.
Teknik mastering sonra teknik gelecekteki uygulamalar büyük bir esneklik sunmak. Çeşitli diğer 18F etiketli sonda ve özel biyokimyasal çalışmaya proton bileşikler mümkün olduğunca Örneğin, (Örneğin, fluorescently tagged antikorlar) diğer kollarındaki veya floresan etiketlerin kullanımını da, yararlanılabilir yollar veya tümör/BM microenvironment işlemlerinde. Nedeniyle kısa yarılanma çoğunun bu radionucleotides birden çok seri ölçümler belirli bir deney süresince ilaç alımı, dağıtım, kinetik ve çürüme eğitim için yapılmış olabilir. Diğer probları (Örneğin,18F-fluoro-2deoxyglucose [18F-FDG] ve 18 kullanarak bu xenograft model, anaerobik glikoliz ve diğer metabolik yollar (yani, yağ asidi sentezi) kullanma özelliğini mm F-Fluoro-4-Thia-Palmitate [FTP])16,17, hem de yeteneği başka yaygın olarak kullanarak tedavi anti-proliferatif etkilerini ölçmek için kullanılan sonda (yani, 3'-deoksi-3'-[18F] fluorothymidine [ 18F-FLT]) Deneysel tasarımlar dahil edilebilir. Buna ek olarak, doğrudan hücre ölümü apoptozis vivo içinde18ölçmek için 18F Annexin B1 kullanarak ölçmek mümkün olabilir. Bu bileşiklerin çoğu ticari olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar Kevin Francis Perkin-Elmer bir çalışandır.
Acknowledgments
Bu eser VA hak grant1I01BX001532 gelen Amerika Birleşik Devletleri Bakanlığı gazileri işleri Biyomedikal Laboratuvarı araştırma tarafından desteklenen ve geliştirme hizmeti (uymuyor) PF ve ak VA klinik bilim R & D hizmet (destek kabul eder. Liyakat Ödülü I01CX001388) ve VA rehabilitasyon R & D hizmet (Merit Ödülü I01RX002604). Daha fazla destek bir UCLA öğretim tohum hibe JK için geldi. Bu içeriği mutlaka bize Department of Veterans Affairs veya ABD hükümeti görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
- Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
- Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).
- Anderson, K. C., Carrasco, R. D.
- Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
- Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025 (2013).
- Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
- Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
- Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
- Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
- Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
- Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
- Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).
- Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
- Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
- Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
- Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).
