Necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu
Summary
Biz yöntemleri konvansiyonel ve confocal live-cep mikroskobu görüntüleme, dahil olmak üzere necroptosis MLKL-aracılı plazma zarı kopma karakterizasyonu için scanning elektron mikroskobu ve lipid NMR tabanlı bağlama raporu.
Abstract
Necroptosis phosphorylates ve karışık soy kinaz benzeri etki alanı pseudokinase, MLKL rüptürü veya plazma zarı permeabilize, aktive protein kinaz 3 (RIPK3), etkileşim reseptör etkinleştirme tarafından tetiklenen bir programlı hücre ölümü yoludur . Necroptosis otoimmünite, bulaşıcı ve kalp-damar hastalıkları, felç, ateş ve kanser de dahil olmak üzere birden çok patolojileri ile ilişkili inflamatuvar bir yoludur. Burada, MLKL necroptosis plazma zarı kopma cellat olarak karakterize etmek için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Biz necroptosis confocal ve konvansiyonel floresans mikroskobu ile canlı hücre Imaging’i kullanma hücreleri ve sabit hücrelerin elektron mikroskobu, birlikte plazma için sitozol üzerinden MLKL dağıtılması ortaya kullanarak işlem görselleştirmek membran plazma zarı büyük delikler indüksiyon öncesinde. Biz MLKL-aracılı necroptosis sözde modülatörler tanımlamak için lipidler kullanarak vitro nükleer manyetik rezonans (NMR) analiz mevcut. Bu yöntem üzerinde bağlı olarak, biz nicel lipid-bağlama tercihleri ve phosphatidyl inositol fosfatlar (pip) MLKL, plazma zarı hedefleme ve necroptosis permeabilization için gerekli olan kritik bağlayıcı olarak tespit edilmiştir.
Introduction
Necroptosis genetik bileşenleri tanımlayan necroptosis dolaylı fizyolojisi ve hastalığı1,2,3,4,5‘ te test etmek için hayvan modellerinin kullanımı kolaylaştırdı. RIPK3 veya MLKL nakavt farelerde en az dolaylı geliştirme ve yetişkin homeostazı o necroptosis için hayat3,6şart değil ima vardı. Ayrıca, bazı türler ya RIPK3 ya da MLKL genler, necroptosis olmayan temel rolü hayvanların7,8‘ destek içermez. Öte yandan, çeşitli patolojileri laboratuvarda indüklenen ile nakavt hayvan modelleri zorlu necroptosis inflamasyon, doğuştan gelen bağışıklık ve viral enfeksiyon9,10, önemli bir rol ortaya koymuştur 11 , 12.
Necroptosis etkinleştirilmesi birkaç şekilde farklı doğuştan gelen bağışıklık sensörler sinyal tarafından tüm belgili tanımlık harekete geçirmek RIPK31,13,14hangi sonucu. Active RIPK3 sırayla phosphorylates ve MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 etkinleştirir ,11,12,13,14,15,16,17,18. En iyi okudu ve belki de RIPK3 aktivasyonu için önde gelen en karmaşık yolu da apoptozis ya da necroptosis1ikna etmek için sinyal kompleksleri aşağı akım kompozisyona göre hangi bifurcates ölüm reseptör ligasyonu, geçiyor. RIPK1 sinyal tercih edilir ve nişan RIPK319,20sonuç Necroptosis ensues. Bu sonuç kolayca farmakolojik inhibisyon veya caspase 8, bir sözde endojen inhibitörü olan necroptosis koyunda tutar necroptosis genetik silinmesi üzerine tercih edilir. RIPK1 bağlar ve RIPK3’ı etkinleştirir. Necroptosis etkinleştirmek için başka bir yol TLR3/TLR4 Toll benzeri reseptörler sinyal aracılığıyla yürütmektedir ve RIPK3 tır etki alanını içeren bağdaştırıcı indükleyici interferon-β (TRIF)21aktive olduğu. Henüz doğrudan yürütmektedir ve RIPK322etkinleştirir DNA sensör DAI, etkinleştirme tarafından necroptosis tarafından ölmek için başka bir yol olduğunu.
MLKL bir N-terminal helix paket (NB) ve bir düzenleyici küme ayracı bölge3ile bağlantılı bir C-terminal pseudokinase etki alanı (psKD) oluşan sitozolik bir proteindir. Normal hücrelerde, MLKL nereye RIPK314ile etkin olmayan bir karmaşık olduğu düşünülen sitozol bulunur. Harekete geçirmek-in necroptosis MLKL RIPK3 fosforilasyon harekete geçirmek ilmik psKD ve NF ve kaşlı ayraç3,15,23yılında potansiyel olarak ek siteler içinde tetikler. Fosforilasyon ayrılma RIPK314sonuç MLKL konformasyon bir değişiklik neden olmaktadır. Kötü anlaşılır konformasyon değişiklikleri küme ayracı psKD24yayın. 2 sarmal içeren küme ayracı, MLKL Oligomerizasyonda sözde trimer ile C-terminal helix25içine aracılık eder. Brace N-terminal helix membran permeabilization24,26için gerekli olan NB etki alanı engeller. Tecrit NB etki alanı plazma zarı permeabilization ve necroptosis16,24,27ikna etmek yeterlidir. NB pro-necroptotic etkinliği içinde fare embriyonik fibroblastlar MLKL (mlkl– / – MEFs) eksik öldürüldüğüne tanıklık etmişlerdir. NB tercihen fosfolipid phosphatidylinositol 4,5 nükleotittir (PIP2) yürütmektedir bir lipid bağlayıcı etki alanıdır. Biz MLKL, onda MLKL alımı için plazma zarı NB zayıf etkileşimler PIP2 kutup baş grup24ile üzerinden küme ayracı Oligomerizasyonda kolaylaştırır aktivasyon kademeli bir mekanizma önerdi. Membran NB PIP2etkin olmayan MLKL brace tarafından maskeli için bir ek yüksek afinite bağlama sitesinin düzenlenmiş pozlama uğrar. Genel olarak, her ne kadar bu olayların moleküler mekanizması-değil var aydınlatılmamıştır NB birden çok etkileşimler PIP2 ile onun kopmalara önde gelen plazma zarı istikrarsızlaştırmak.
Burada MLKL işlevini necroptosis24cellat tanımlamak için kullanılan belirli yöntemleri gösterilmektedir. Özellikle, biz odaklanmak en az etki alanı MLKL, NB ve küme ayracı (NBB), hangi küme ayracı inhibisyon tarafından düzenlenir ve plazma membran rüptürü ve necroptosis ikna etmek için zorunlu dimerization ile aktif hale getirebilirsiniz. Biz zorunlu uyuşturucu kaynaklı FKBP-aracılı dimerization canlı hücre görüntüleme ve necroptosis geçiren hücrelerin elektron mikroskobu ile birlikte bizim indüklenebilir ifade sistemi açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim vitro NMR Analizi NBB etkileşimleri ile phosphatidylinositols (pip) göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
MLKL plazma zarı yırtılması24sözde cellat karıştığı için kombine teknikleri için iletişim kuralları sağlar. Necroptosis MLKL-aracılı düzenleyen yasal ağ deşifre ek olarak, bu tekniklerin uygun diğer biyolojik sistemleri tanımlamak için bağımsız olarak kullanılabilir. Pratik olarak konuşursak, bu teknikleri orta-düşük verimi keşif araçları vardır.
Biz düzenli olarak canlı hücre görüntüleme NBB140kullandık-2xFV-Venüs-a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri.
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
Riferimenti
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
