Bedömning av Synaptic gränssnittet för primära humant T-celler från perifert blod och lymfatisk vävnad
Summary
Protokollet beskriver en teknik för att studera primära polyklonala mänskliga T cellernas förmåga att bilda synaptic gränssnitt använder planar lipid lipidmonolager. Vi använder denna teknik för att Visa differentiell synaps bildas förmåga mänskliga primära T-celler som härrör från lymfkörtlar och perifert blod.
Abstract
Aktuell kunskap om dynamiken och strukturella funktioner av T-cell synaptic gränssnitt har varit till stor del bestäms genom användning av glas-stödda planar lipidmonolager och in vitro--härledda T-cell kloner eller linjer1,2 ,3,4. Hur dessa fynd gäller för de primära mänskliga T cellerna isolerade från blod eller lymfoida vävnader är inte känd, delvis på grund av betydande svårigheter att få ett tillräckligt antal celler för analys5. Här kan vi bemöta detta genom utveckling av en teknik som utnyttjar flerkanaliga flöde diabilder för att bygga planar lipid lipidmonolager innehållande aktivering och vidhäftning molekyler. Den låga höjden flöde bilder främjar snabb cell sedimentering för att synkronisera cell: lipidens fastsättning, vilket innebär att forskare att studera dynamiken i synaptic gränssnitt bildandet och kinetik av granulat release. Vi tillämpar detta synsätt för att analysera synaptic gränssnittet för så få som 104 105 primära frysförvarade T celler isolerade från lymfkörtlar (LN) och perifert blod (PB). Resultaten visar att romanen planar lipid lipidens tekniken möjliggör studiet av biofysiska egenskaper av primära humant T-celler som härrör från blod och vävnader i samband med hälsa och sjukdom.
Introduction
Vetenskapliga kunskapen om strukturella drag hos T-cell immun synapser och deras koppling till den funktionella aktiviteten av T-celler har genererats främst från studien av cellinjer och kloner härledda från PB. Till vilken grad dessa fynd avser primära T-celler som erhållits från oklar blod eller mänskliga lymfoida vävnader, eftersom de synaptiska gränssnitt av T-celler som är bosatta i lymfoida och andra vävnader inte har analyserats hittills. Ännu viktigare, tyder framväxande data på att vävnaden boförälder och lymfoida organ-härledda T-celler kan ha betydande skillnader i deras fenotyp och funktionell aktivitet jämfört med dem i PB6,7. Detta stelnat ytterligare behovet av att bättre förstå funktionerna i T-cell synaptic gränssnittet i primära humant T-celler.
För detta ändamål har vi utvecklat en ny mini skala strategi att utnyttja lipid lipidmonolager inbyggt flerkanaligt flöde bilder gör det möjligt för oss att utföra avbildning av T-cell/lipidens gränssnitt med mindre än 105 primära T celler isolerade från mänskliga PB och LN. Denna nya teknik gör studien av primära humant T-cell synaptic gränssnitt för att bättre modell och förstå i vivo cell-cell interaktioner biofysiska egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nya teknik som beskrivs här använder liknande reagenser som krävs för att bygga planar lipidmonolager i konventionella flöde cell5 och framgångsrikt kan användas för att utföra avbildning av primära human T cell – lipidens gränssnitt3,4 ,15. Tekniken erbjuder en betydande minskning i den fluorescerande molekyler användningen och kräver 10 – 20 x färre T-celler jämfört med en flöd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av R01AI118694 NIH bidraget till Michael R. Betts, vilket inkluderar sub award 566950 till Yuri Sykulev. Vi tackar Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging delade resursen för deras utmärkta stöd.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
