혈 청 무료 조건에서 소 granulosa 셀의 장기적인 문화 모델을 설명 합니다. 이 모델에서는 다른 도금 밀도에 스 트로 겐 생산의 특성으로 다양 한 요인의 효과 연구 하는 연구원 소 granulosa 셀.
난소 granulosa 셀 (GC)는 estradiol 합성의 주요 소스입니다. Preovulatory 황 호르몬 (LH) 서 지에 의해 유도 된 세포는 티크의 및, 특히, granulosa 셀 계층의 뿌리깊은 그들의 형태, 생리, 및 분자 특성 변경 및 황 체 호르몬 생성 신체를 형성 임신을 유지 하기 위한 책임이 있다는 luteum 셀 문화 모델 folliculo-luteal 변환에 관련 된 기본 규제 메커니즘 연구 필수 도구입니다. 제시 프로토콜 격리 절차 및 중간 소형 낭 (< 6 m m)에서 소 GC의 cryopreservation에 집중 한다. 이 기술로, GC의 거의 순수한 인구를 얻을 수 있습니다. Cryopreservation 절차는 크게 시간 세포 배양의 관리는 직접 기본 조직 (난소) 공급의 독립적인 작동을 지원 합니다. 이 프로토콜에서는 소 GC의 estradiol 액티브 상태를 모방 하는 혈 청 무료 셀 문화 모델을 설명 합니다. 성공적인 스테로이드 활성 세포 배양에 필수적인 중요 한 조건은 프로토콜에 걸쳐 설명 되어 있습니다. 그것은 그 세포의 도금 밀도 증가 유도 특정 응답 변경된 진 식 프로필과 호르몬 생산에 의해 표시 된 대로 설명 했다. 또한,이 모델은 GC 차별화에 대 한 추가 연구를 위한 기초 및 다른 응용 프로그램을 제공합니다.
성공적인 배 란과 luteinization 정밀 하 게 조정 하 고 잘 조율 된 분자 변경 다른 체세포 follicular 셀 형식에 따라 달라 집니다. 이러한 개발 프로세스의 세부 정보는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 때문에, 더 정화가 필요 합니다. Vivo에서 접근 정교 하 고 비용이 많이 드는 이며, 특히 folliculogenesis 동안 발생 하는 주소 특정 분자 메커니즘을 실패 합니다. 따라서, reductionistic 생체 외에서 모델 필요 또한, 세포질이 고 분자 세부 사항에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 다른 연구는 체 외 수정 기술1,2, 에서 3의 맥락에서 전체 낭의 문화를 설명합니다. 연구원은 차별화의 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 많은 연구 follicular GC에 초점. 직접 oocyte와 관련 된 이러한 셀 스 트로 겐 생산의 주요 소스 이며, 따라서, folliculogenesis 및 luteinization4에 걸쳐 필수적인 역할.
셀 라인 GC의 다른 종에서 개발 되었습니다 불후 그러나 그들의 대부분은, 충분 한 스테로이드 호르몬 생산5표시 되지 않습니다. 지금까지, 하나의 셀 라인 GC 되었습니다 소의 설립6, 그러나이 선 여러 구절7후 steroidogenic 활동을 잃었다. 따라서,부터 steroidogenesis 그리고, 특히에서, estradiol 생산 GC 기능의 필수적인 기능입니다, 그리고 그것은 이러한 측면에서 1 차 셀 문화 모델을 공부 하는 것이 좋습니다. 이전 학문에서는, 그것은 상당한 estradiol 생산 세럼 무료 문화 조건8,9아래만 관찰 될 수 있는 시연 했다. 더욱, estradiol 종합의 선구자의 보충은 또 다른 필수 구성 요소, GC androstenedione10프로 변환할 수 있습니다 필요한 효소를 표현 하지 못하는. 또한, FSH 및 IGF-1 보충에서 체 외에서 의 시너지 효과 estradiol 합성11의 주요 효소 aromatase의 최적화 된 활동을 밝혔다. 현재 프로토콜에서 GC 문화 모델에 상당한 영향을 미칠 다른 중요 한 요인은 또한 설명 합니다. 특히, 셀 밀도 도금 실험12의 결과에 엄청난 영향을 있다. 또한, GC 생리학 문화에 크게 방해 하지 않는 소 GC의 cryopreservation 기술 수립 될 수 있습니다. 이 기술은 세포 문화 작품의 조직 개선 하 고 선호 도금 밀도 최적화 하기 위해 도움이 됩니다.
제시 셀 문화 모델 granulosa 셀 차별화 시험관을 분석 하는 도구를 제공 합니다. 여러 연구 결과 혈 청 무료 재배 경작된 소 GC 또는 다른 종8,9의 GC에서 스테로이드 활동을 유지 하기 위해 필수 보여주었다. 또한 기질 (예를 들어, 콜라겐 R)13의 구성 요소와 문화 접시 코팅, 크게 향상의 셀 첨부 파일. 또 다른 중요 한 기능은 장기 문화 기간입니다. 최근에, 그것은 장기 문화는 충분 한 steroidogenic 활동과 granulosa 셀 정체성 마커17의 균형된 식을 얻기 위해 필요한 증명 되었습니다. 그것은 GC 물리적 스트레스 로부터 격리 절차 동안 복구 시간을 필요로 나타납니다.
FSH, IGF-1, androstenedione 알려져 있습니다에서 aromatase 활동을 유도 하기 위해 미디어 보충 교양 GC. 특히, androstenedione와 보완은 절대적으로 필요한, GC로 필요 전조 estradiol 합성 합니다. 이것은 계속 이전11,18 에 게시 하 고, 따라서 하지 추가 조사는 현재 연구 중. 그러나, FSH, IGF-1, 그리고 androstenedione 농도의 적응은 다른 실험 설정에 대 한 필요할 수 있습니다.
여기에 설명 된 cryopreservation 기술을 더 난소와 다양 한 공급에서 독립 함으로써 조직 배양 실험 기구를 개선 하기 위해 도울 수 있다. 이전 테스트에 따르면 cryopreservation GC 형 또는 스테로이드 생산 문화에 미치지 않는다. 또한, 경작된 한 세포에 표식 증명서의 풍부는 이전 cryopreservation16에 들어서는 그 갓 고립 된 세포에서 준비 하는 샘플을 비교 하는 중요 한 차이점이 공개 하지 않았다.
현재 GC 문화 모델에 대 한 중요 한 매개 변수는 밀도 도금 하는 셀입니다. 대표 결과같이 생리 및 분자 특성의 놀라운 변화를 유도 도금 밀도 증가. 몇몇 유전자는 LH 자극 vivo에서4,19에 의해 유도 되는 변화를 닮은 특정 방식으로 통제 된다. 한 증가 셀 밀도 교양된 소 GC 차별화와 같은 프로세스를 구동할 수 있다 사실 꼼꼼하게 복제 사이 충돌 하는 결과 피하기 위해이 GC 모델 체 외에 간주 있다. 따라서, 다른 연구 결과와 모순 된 결과 다른 셀 밀도를 관찰 수 있습니다 그리고 더 면밀 하 게 조사 해야 합니다.
설명 된 문화 모델 LH에 응답 하지 않는 것을 여기 공개 LHCGR 수용 체의 성적으로는 검출 한계. 따라서, 모두 LH 서 지의 시뮬레이션 vivo에서 상황 차별화13유도를 하지 못했습니다. 그럼에도 불구 하 고, estradiol-액티브 GC 주 문화에서를 공부 하는 유용한 도구를 제공 하는이 모델, 현재 존재 하는 특히 더로 기능 소 GC 라인.
스테로이드 생산 또는 GC 차별화의 규제 메커니즘을 해명 하는 데 도움이 현재 GC 문화 모델에서 다른 치료 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 개발 프로세스에 관련 된 추가, 단일 요소를 개별적으로 분석할 수 있습니다. 따라서,이 문화 모델은 많은 다른 응용 프로그램에 대 한 기반을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리 감사 베로니카 Schreiter 그녀의 우수한 기술 지원과 설립된 cryopreservation 기술과 세포 문화 모델의 도움이 수정. 또한, 우리는 이후 분석에 그들의 우수한 기술 지원에 대 한 마 렌 앤 더 스와 Swanhild Rodewald 감사 드리고.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |