Een lange termijn model van de cultuur van boviene granulosa cellen onder voorwaarden serumvrij wordt beschreven. Met dit model kunnen onderzoekers aan het bestuderen van de effecten van verschillende factoren en voorwaarden als verschillende plating dichtheden over de kenmerken van het oestrogeen-producerende boviene granulosa cellen.
Ovariële granulosa cellen (GC) zijn de voornaamste bron van estradiol synthese. Geïnduceerd door de preovulatory luteïniserend hormoon (LH)-schommeling, cellen van de theca en, in het bijzonder de cellaag granulosa diep wijzigen hun morfologische, fysiologische en moleculaire kenmerken en vormen de progesteron-producerende corpus luteum die verantwoordelijk is voor het behoud van de zwangerschap. Cel cultuur modellen zijn essentiële instrumenten om te bestuderen van de onderliggende regulerende mechanismen betrokken bij de folliculo-luteale transformatie. Het gepresenteerde protocol richt zich op de isolatie procedure en cryopreservatie van boviene GC van kleine tot middelgrote follikels (< 6 mm). Met deze techniek, kan een bijna pure bevolking van GC worden verkregen. De cryopreservatie procedure vergemakkelijkt aanzienlijk tijd beheer van de cultuur van de cel werken onafhankelijk van een directe primaire weefsel (eierstokken) levering. Dit protocol beschrijft een serumvrij cel cultuur model dat de estradiol-actieve status van boviene GC nabootst. Belangrijke voorwaarden die essentieel voor een cultuur van de succesvolle steroïde-actieve cel zijn worden besproken in het gehele protocol. Het is aangetoond dat verhoging van de dichtheid van de beplating van de cellen een specifieke reactie, induceert zoals aangegeven door een veranderd gen expressie profiel en hormoon productie. Bovendien biedt dit model een basis voor verdere studies op GC differentiatie en andere toepassingen.
Succesvolle ovulatie en luteinization zijn afhankelijk van fijn afgestemd en goed georkestreerde moleculaire veranderingen in verschillende somatische folliculaire celtypes. Omdat de details van deze ontwikkelings processen worden nog niet volledig begrepen, verdere is verduidelijking vereist. In vivo benaderingen zijn uitgebreide en dure en, in het bijzonder niet adres specifieke moleculaire mechanismen die tijdens de folliculogenese optreden. Daarom zijn reductionistische in vitro modellen bovendien nodig om inzicht geven in de cellulaire en moleculaire details. Verschillende studies beschrijven de cultuur van hele follikels in het kader van de in vitro fertilisatie technieken1,2,3. Omdat onderzoekers ook geïnteresseerd in de mechanismen van differentiatie zijn, richten veel studies op folliculaire GC. Deze cellen, die rechtstreeks verband houden met de oöcyt, zijn de belangrijkste bronnen van oestrogeen productie en dus spelen een essentiële rol in de gehele folliculogenese en luteinization4.
Vereeuwigd cel lijnen van GC hebben ontwikkeld van verschillende diersoorten. De meeste van hen, vertonen echter geen een voldoende steroïde hormoon productie5. Tot nu toe slechts één cel van runderen die GC is vastgesteld6, maar deze lijn verloor zijn steroidogenic activiteit na verscheidene passages7. Daarom sinds steroidogenesis en, in het bijzonder, estradiol productie is een wezenlijk kenmerk van GC functionaliteit, is het raadzaam om deze aspecten in de primaire cel cultuur modellen bestuderen. In eerdere studies, werd aangetoond dat een aanzienlijke estradiol productie kan alleen worden waargenomen onder serumvrij cultuur voorwaarden8,9. Verder is, de suppletie van een voorloper van estradiol synthese een andere voorwaarde, zoals GC nalaten de nodige enzym dat progesteron in androstenedione10 omzetten kuntkenbaar. Bovendien bleek het synergetische effect van FSH en IGF-1 suppletie in vitro een geoptimaliseerde activiteit van aromatase, het sleutelenzym van estradiol synthese11. In het huidige protocol, worden ook andere belangrijke factoren die een aanzienlijke invloed op de GC cultuur model hebben beschreven. In het bijzonder heeft de cel plating dichtheid enorme gevolgen voor de resultaten van het experiment12. Bovendien, een techniek cryopreservatie van boviene GC die niet aanzienlijk met GC fysiologie in cultuur interfereert kon worden vastgesteld. Deze techniek helpt om de werkorganisatie cel cultuur en voor het optimaliseren van de voorkeur plating-dichtheid.
De gepresenteerde cell cultuur model biedt een instrument om te analyseren granulosa cel differentiatie in vitro. Verschillende studies is gebleken dat een serumvrij teelt een voorwaarde is voor het behoud van steroïde activiteit in gekweekte boviene GC of GC van andere soorten8,9. Daarnaast verbeterd de cultuur schotel met componenten van de extracellulaire matrix (bv, collageen R)13coating, de bevestiging van de cellen aanzienlijk. Een ander belangrijk kenmerk is de periode van langdurige cultuur. Onlangs is gebleken dat een langetermijnkweek noodzakelijk om voldoende steroidogenic activiteit en een evenwichtige uitdrukking van granulosa cel identiteit markers17te verkrijgen is. Het lijkt erop dat GC de tijd nodig om te herstellen van de fysieke belasting tijdens de procedure van de isolatie.
De supplementen van de media FSH, IGF-1 en androstenedione zijn bekend voor het opwekken van aromatase activiteit in gekweekte GC. Vooral de suppletie met androstenedione is absoluut noodzakelijk, als de GC moet een voorloper voor estradiol synthese. Dit is al eerder gepubliceerd11,18 en daarom was niet verder onderzocht tijdens de huidige studie. Een aanpassing van FSH, IGF-1 en androstenedione concentraties kunnen echter nodig voor andere experimentele opstellingen.
De hier beschreven cryopreservatie-techniek kan bijdragen tot verbetering van de organisatie van weefselkweek experimenten doordat ze meer onafhankelijk van het wisselende aanbod met de eierstokken. Volgens eerdere testen, beïnvloedt cryopreservatie niet de GC fenotype of steroïde productie in cultuur. De overvloed van marker afschriften in gekweekte cellen openbaarde ook niet verschillen vergelijken bereid uit vers geïsoleerde cellen met die voorheen onderworpen aan cryopreservatie16monsters.
Een cruciale parameter voor het huidige GC cultuur model is de cel plating dichtheid. Zoals blijkt uit de Resultaten van de vertegenwoordiger, geïnduceerde verhogen van de dichtheid van de beplating opmerkelijke veranderingen van fysiologische en moleculaire kenmerken. Verschillende genen worden geregeld op een specifieke wijze, die lijkt op de veranderingen die zijn geïnduceerd door LH stimulatie in vivo4,19. Het feit dat een toenemende celdichtheid differentiatie-achtige processen in gekweekte boviene GC rijden kan moet zorgvuldig worden beschouwd in dit GC in vitro model om te voorkomen dat tegenstrijdige resultaten tussen wordt gerepliceerd. Daarom tegenstrijdige resultaten met andere studies kunnen worden toegeschreven aan andere cel dichtheden en nauwer moeten worden onderzocht.
Het model van de cultuur beschreven hier bleek te zijn niet-reagerend aan LH, als de transcripties van de receptor LHCGR zijn dicht bij de detectiegrens. Vandaar, een simulatie van de LH-piek zowel de situatie in vivo is mislukt voor het opwekken van differentiatie13. Echter dit model biedt een nuttig hulpmiddel om te bestuderen van estradiol-actieve GC in primaire cultuur, met name als geen functionele boviene GC lijnen bestaan op dit moment.
Verschillende Behandelprotocollen kunnen worden getest in de huidige cultuur model voor GC die helpen te ontrafelen van regulerende mechanismen van steroïde productie of GC differentiatie. Verdere, enkele factoren die bij de ontwikkelings processen betrokken zijn kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd. Daarom is deze cultuur-model biedt een basis voor vele verschillende toepassingen.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Veronica Schreiter voor haar uitstekende technische bijstand en nuttige wijzigingen van het gevestigde cryopreservatie techniek en cel cultuur model. Daarnaast willen we Maren Anders en Swanhild Rodewald bedanken voor hun uitstekende technische bijstand in de daaropvolgende analyse.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |