מודל התרבות ארוכת טווח של תאים granulosa שור בתנאים ללא סרום מתואר. מודל זה מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של גורמים שונים ותנאים כמו ציפוי שונים צפיפויות על המאפיינים של ייצור אסטרוגן בתאי granulosa שור.
תאים granulosa השחלות (GC) הם המקור העיקרי של אסטרדיול סינתזה. המושרה על ידי גל הורמון מחלמן preovulatory (LH), תאי theca את, בפרט, granulosa תא השכבה עמוקות לשנות מאפיינים מורפולוגיים, הפיזיולוגית המולקולרי שלהם ויוצרים הקורפוס ייצור פרוגסטרון התשובה כי הוא אחראי על שמירת הריון. תא תרבות הן כלי חיוני ללמוד את מנגנוני הרגולציה כבסיס מעורב הטרנספורמציה folliculo-luteal. פרוטוקול הציג מתמקד הליך הבידוד של הקפאה קריוגנית של שור GC של זקיקים קטן-בינוני (< 6 מ מ). בטכניקה זו, ניתן להשיג אוכלוסיה טהור של GC. ההליך הקפאה קריוגנית מאוד מקל זמן ניהול של התרבות תאים לעבודה עצמאית של היצע רקמות (השחלות) ישיר הראשי. פרוטוקול זה מתאר תרבות ללא סרום תא מודל המחקה את מצב פעיל אסטרדיול GC שור. תנאים חשובים כי הם חיוניים עבור תרבות מוצלח תא סטרואידים-פעילה הם דנו לאורך כל הפרוטוקול. הוכח כי הגדלת הצפיפות ציפוי של התאים גורם לתגובה ספציפית כמצוין על-ידי פרופיל ביטוי וייצור הורמונים ג'ין שינו. יתר על כן, מודל זה מספק בסיס ללימודי ב- GC בידול ויישומים אחרים.
ביוץ מוצלחת ואת luteinization תלוי שינויים מולקולריים דק מכוון, מתוזמר היטב סוגי התאים הזקיקים סומאטית. מאז פרטים של תהליכים התפתחותיים אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, עוד יותר להבהרה נדרש. In vivo גישות משוכללות ויקרות, בפרט, להיכשל כתובת המנגנונים המולקולריים ספציפיות המתרחשות במהלך folliculogenesis. לכן, מודלים reductionistic במבחנה נדרשים בנוסף, כדי לספק תובנות פרטים תאית ומולקולרית. מחקרים שונים מתארים את התרבות של כל זקיקי בהקשר של במבחנה הפריה טכניקות1,2,3. כי החוקרים מעוניינים מנגנונים של בידול, מחקרים רבים מתמקדים GC הזקיקים. תאים אלה, הקשורים ישירות oocyte, הם המקורות העיקריים של ייצור אסטרוגן, לכן, תפקיד חיוני בכל רחבי folliculogenesis ו- luteinization4.
מונצחים תא שורות של GC פותחו זנים שונים. עם זאת, רובם, אינם מראים ייצור הורמונים סטרואידים מספיקות5. עד כה, תא אחד בלבד שורה של שור ש-GC כבר הקים6, אך הקו הזה איבד את פעילותה שחלת בקר לאחר קטעים מספר7. לכן, מאז steroidogenesis, ובעיקר, אסטרדיול הפקה היא תכונה חיונית הפונקציונליות GC, מומלץ ללמוד היבטים אלה במודלים התרבות התא הראשי. במחקרים קודמים, הוכח כי הפקה אסטרדיול ניכר יכול רק להיות שנצפו תחת תרבות סרום ללא תנאים8,9. בהמשך, תוספת של הסימן המקדים של אסטרדיול סינתזה היא תנאי הכרחי נוסף, כפי GC להיכשל להביע את האנזים הנחוץ ניתן להמיר androstenedione10פרוגסטרון. בנוסף, אפקט סינרגיסטי של FSH ו- IGF-1 תוספי במבחנה חשף פעילות אופטימיזציה של ארומטאז, האנזים מפתח של אסטרדיול סינתזה11. בפרוטוקול הנוכחי, מתוארים גם גורמים חשובים אחרים, שיש להם השפעה משמעותית על המודל התרבות GC. בפרט, התא יופיצ צפיפות יש השפעות עצומה על התוצאה של ניסוי12. יתר על כן, יכול להקים טכניקה הקפאה קריוגנית של GC שור זה אינם מתערבים באופן משמעותי GC פיזיולוגיה בתרבות. טכניקה זו מסייעת לשפר את הארגון של התא תרבות עבודה כדי למטב את הצפיפות ציפוי המועדפת.
המודל התרבות התא שהוצגו מספקת כלי לניתוח granulosa תא בידול חוץ גופית בתוך. מספר מחקרים הראו כי הטיפוח-תרגול ללא סרום הוא תנאי הכרחי לשמירה על פעילות סטרואידים הם אורגניים GC שור או GC של מינים אחרים,8,9. בנוסף, ציפוי המנה תרבות עם רכיבים של מטריצה חוץ-תאית (למשל, קולגן R)13, שיפור ההחזקה של התאים באופן משמעותי. תכונה חשובה נוספת היא תקופת תרבות ממושך. . לאחרונה, זה הוכח כי תרבות לטווח ארוך יש צורך לקבל ביטוי מאוזן של granulosa תא זהות סמני17ופעילות שחלת בקר מספקת. נראה כי GC דורשים את הזמן כדי להתאושש מן הלחץ הפיזי במהלך ההליך בידוד.
תוספי מדיה FSH, IGF-1 ו androstenedione ידועים לזירוז פעילות ארומטאז תרבותי GC. במיוחד, תוספי עם androstenedione הכרחי לחלוטין, כמו GC הצורך הקדמה אסטרדיול סינתזה. זה כבר פורסם בעבר11,18 ו, לכן, לא עוד יותר נחקר במהלך המחקר הנוכחי. עם זאת, עיבוד של FSH, IGF-1, ובתמצית androstenedione ייתכן שיהיה צורך אחרים set-ups ניסיוני.
הקפאה קריוגנית בטכניקה המתוארת כאן יכול לעזור לשפר את הארגון של תרביות רקמה ניסויים על ידי הפיכתם עצמאית יותר מן ההיצע בדרגות שונות עם השחלות. על פי בדיקות קודמות, הקפאה קריוגנית אינה משפיעה על פנוטיפ GC או ייצור הסטרואידים בתרבות. כמו כן, השפע של סמן תעתיקים בתאים בתרבית לא חשפו הבדלים משמעותיים השוואת דוגמיות מקריסטלים של תאים בודדים טרי עם אלה נתון בעבר הקפאה קריוגנית16.
פרמטר קריטי עבור המודל הנוכחי של תרבות GC הוא התא יופיצ צפיפות. כפי שמוצג על ידי נציג תוצאות, הגדלת הצפיפות ציפוי המושרה שינויים יוצא דופן של מאפיינים פיזיולוגיים ומולקולרית. מספר גנים מוסדרים באופן ספציפי, הדומה השינויים הם המושרה על ידי גירוי LH ויוו4,19. העובדה כי צפיפות גדל והולך התא יכול לנהוג דמוי-התמיינות תהליכים ב- GC שור בתרבית צריך להיחשב בקפידה במודל זה GC במבחנה כדי למנוע תוצאות סותרות בין משכפל. לכן, תוצאות סותרות עם מחקרים אחרים ייתכן ולשייך צפיפויות תאים שונים, יש לבחון מקרוב יותר.
המודל התרבות המתואר כאן מתגלה כי שאינם מגיבים LH, כמו התמלילים של הקולטן LHCGR נמצאים בקרבת הגבול זיהוי. לפיכך, סימולציה של גל LH כאחד המצב ויוו נכשל לזירוז בידול13. בכל זאת, מודל זה מספק כלי שימושי ללמוד GC אסטרדיול-פעיל בתרבות העיקרי, בפרט כמו לא פונקציונלי-שור GC שורות קיימות כיום.
פרוטוקולי טיפול שונה יכול להיבדק במודל תרבות נוכח GC לעזור לפענח את מנגנוני הרגולציה של ייצור סטרואידים או בידול GC. גורמים נוספים, אחד המעורבים בתהליכים התפתחותיים יכול להיות מנותח בנפרד. לכן, מודל זה תרבות מספק בסיס עבור יישומים שונים רבים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ורוניקה Schreiter על סיוע טכני מעולה שלה והשינויים מועיל של הקפאה קריוגנית הוקמה טכניקה ותא תרבות המודל. בנוסף, אנחנו רוצה להודות אנדרס Maren, Swanhild Rodewald לסיוע טכני מעולה שלהם בניתוח עוקבות.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |