En långsiktigt kultur-modell av nötkreatur granulosa celler serumfritt villkor beskrivs. Denna modell tillåter forskare att studera effekterna av olika faktorer och villkor som olika plätering tätheter på kännetecknen av östrogen-producerande nötkreatur granulosa celler.
Ovariell granulosa celler (GC) är den huvudsakliga källan av estradiol syntes. Induceras av den preovulatory luteiniserande hormon (LH) kraftigt, celler i theca och, i synnerhet det granulosa celllagrar djupt ändra deras morfologiska, fysiologiska och molekylära egenskaper och bilda progesteron-producerande corpus luteum som ansvarar för att bibehålla graviditeten. Cell kultur modeller är viktiga verktyg för att studera de underliggande reglerande mekanismerna som är involverade i folliculo-luteala omvandlingen. Presenterade protokollet fokuserar på isolering förfarande och Frysförvaring av nötkreatur GC från små – till medelstora folliklar (< 6 mm). Med denna teknik, kan en nästan ren befolkning på GC erhållas. Förfarandet för frysförvaring underlättar avsevärt tid förvaltning av cellkulturen arbeta oberoende av en direkt primär vävnad (äggstockar) leverans. Det här protokollet beskriver en modell av serum-fri cell-kultur som härmar estradiol-aktiv status för nötkreatur GC. Viktiga förutsättningar som är nödvändiga för en framgångsrik steroid-aktiv cellkultur diskuteras i hela protokollet. Det är visat att öka plätering tätheten av celler inducerar ett specifikt svar som indikeras av en förändrad gen uttryck profil och hormon produktion. Denna modell ger dessutom en grund för fortsatta studier på GC differentiering och andra program.
Lyckad ägglossning och luteinization beror på fint avstämt och väl iscensatt molekylära förändringar i olika somatiska follikulära celltyper. Eftersom Detaljer för dessa utvecklingsprocesser inte är ännu helt klarlagda, ytterligare krävs förtydligande. In vivo -metoder är genomarbetade och kostsamma och, i synnerhet inte adressen specifika molekylära mekanismer som uppstår under folliculogenesis. Därför behövs reduktionistiskt in vitro- modeller dessutom att ge insikt i cellulära och molekylära detaljer. Olika studier beskriver kulturen i hela folliklar i samband med in vitro- fertilisering tekniker1,2,3. Eftersom forskare är intresserad av mekanismer för differentiering, fokuserar många studier på follikulär GC. Dessa celler, direkt förknippade med äggcellen, är de stora källorna till östrogenproduktion och således en viktig roll i hela folliculogenesis och luteinization4.
Odödlig cell linjer av GC har utvecklats från olika arter. De flesta av dem, dock visar inte en tillräcklig steroid hormon produktion5. Hittills har endast en cell fodrar av nötkreatur GC har varit etablerad6, men denna linje förlorade dess steroidogena aktivitet efter flera passager7. Därför, sedan Steroidsyntes och, i synnerhet, estradiol produktion är en viktig funktion av GC funktionalitet, är det lämpligt att studera dessa aspekter i primär cell kultur modeller. I tidigare studier visades det att en betydande estradiol produktion bara kan observeras under serumfritt kultur villkorar8,9. Ytterligare är, tillskott av en föregångare av estradiol syntes en annan förutsättning, som GC misslyckas att uttrycka det nödvändiga enzym som kan konvertera progesteron till androstendion10. Dessutom avslöjade den synergistiska effekten av FSH och IGF-1 tillskott i vitro en optimerad aktivitet av aromatas, det nyckel-enzymet av estradiol syntes11. I detta protokoll beskrivs också andra viktiga faktorer som har en betydande inverkan på GC kultur modell. I synnerhet har cellen plätering densitet enorma effekter på resultatet av experimentet12. Dessutom kunde en frysförvaring teknik av nötkreatur GC som avsevärt inte stör GC fysiologi i kultur fastställas. Denna teknik bidrar till att förbättra organisationen av cell kulturarbete och optimera Rekommenderad plätering tätheten.
Presenterade cell kultur modellen ger ett verktyg för att analysera granulosa cell differentiering in vitro. Flera studier visade att en serumfritt odling är en förutsättning för att upprätthålla steroid aktiviteten i odlade nötkreatur GC eller GC andra arter8,9. Dessutom förbättrade beläggning kultur skålen med komponenter av extracellulär matrix (t.ex., kollagen R)13, infästningen av cellerna betydligt. En annan viktig funktion är den långvariga kultur perioden. Nyligen har visats det att en långsiktig kultur är nödvändigt att erhålla tillräcklig steroidogena aktivitet och ett balanserat uttryck av granulosa cell identitet markörer17. Det verkar att GC kräver tid att återhämta sig från den fysiska stressen under förfarandet för isolering.
De media kosttillskott FSH, IGF-1 och androstendion är kända för att inducera aromatashämmare i odlade GC. Speciellt, komplettering med androstendion är absolut nödvändig, som GC måste en föregångare för estradiol syntes. Detta har varit publicerade tidigare11,18 och, därför, inte ytterligare undersöktes under den aktuella studien. En anpassning av FSH, IGF-1 och androstendion koncentrationer kan dock vara nödvändigt för andra experimentella uppställningar.
Den frysförvaring teknik som beskrivs här kan bidra till att förbättra organisationen av vävnadsodling experiment genom att göra dem mer oberoende från varierande leverans med äggstockar. Enligt föregående testning, påverkar inte frysförvaring GC fenotyp eller steroid produktion i kultur. Överflödet av markör avskrifter i odlade celler visade också, inte betydande skillnader jämföra prover tillagade färska isolerade celler med de tidigare utsatts för frysförvaring16.
En avgörande parameter för närvarande GC kultur modellen är cellen plätering densitet. Som framgår av Representativa resultat, inducerad öka plätering tätheten anmärkningsvärda förändringar av fysiologiska och molekylära egenskaper. Flera gener regleras i ett särskilt sätt, som påminner om de förändringar som induceras av LH stimulering i vivo4,19. Det faktum att en ökande cell densiteten kan köra differentiering-liknande processer i odlade nötkreatur GC måste anses minutiöst i denna GC in vitro- modell att undvika motstridiga resultat mellan replikat. Därför motsägelsefulla resultat med andra studier kan tillskrivas annan cell tätheter och bör undersökas närmare.
Den kultur-modell som beskrivs här visade sig vara icke-lyhörd för LH, som avskrifter av receptorn LHCGR är nära detektionsgränsen. Därför en simulering av den LH-ökningen både i vivo situationen inte inducerar differentiering13. Ändå denna modell ger ett användbart verktyg för att studera estradiol-aktiva GC i primära kultur, särskilt som inga funktionella nötkreatur GC linjer finns i dagsläget.
Olika behandlingsprotokoll kan testas i nuvarande GC kultur modellen som hjälper till att riva upp regleringsmekanismer steroid produktions-eller GC differentiering. Ytterligare, enda faktorer som är inblandade i utvecklingsprocesser kan analyseras separat. Därför ger denna kultur modell underlag för många olika applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Veronica Schreiter för hennes utmärkta tekniska bistånd och hjälpsamma ändringar av den etablerade frysförvaring teknik och cell kultur modellen. Dessutom vill vi tacka Maren Anders och Swanhild Rodewald för deras utmärkta tekniskt bistånd i den efterföljande analysen.
PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+ | Merck-Millipore | L 182-05 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2213 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
amphotericin (250 µg/ml) | Merck-Millipore | A 2612 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
3 ml syringe (Omnifix Luer) | Braun | 4616025V | |
18 G needle | Roth | C724.1 | |
fetal calf serum | Merck-Millipore | S 0115 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
cryo-preservation vials (2 ml) | TPP Faust | TPP 89020 | |
CoolCell LX cell freezing container | Corning | 432004 | |
culture dish, 24-well, flat bottom | TPP Faust | TPP 92424 | |
collagen R (0.2 %) | Serva | 47254 | |
α-MEM | Merck-Millipore | F 0915 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
L-Glutamin (200 mM) | Merck-Millipore | K 0282 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium bicarbonate | Merck-Millipore | L 1713 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
BSA | Sigma | A3311 | |
HEPES | Merck-Millipore | L 1603 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
sodium selenite | Sigma | S9133 | dissolved in sterile water |
transferrin | Sigma | T1283 | dissolved in sterile water |
insulin (10 mg/ml) | Sigma | I0516 | dissolved in 1x PBS |
NEA | Merck-Millipore | K 0293 | originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists |
FSH | Sigma | F4021 | we prefer to use a stock solution of 2 µg/ml, diluted in 0.9 % NaCl |
LR3-IGF-1 | Sigma | I1146 | we use a stock solution of 2 µg/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA |
androstenedione | Sigma | 46033 | we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol |