ローカライズする Autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用
Summary
プロトコルは、autometallography による鯨の肝臓と腎臓の組織で Ag をローカライズするのに提示されます。さらに、それらのティッシュの Ag 濃度を推定する鯨類の組織学的 Ag 試金 (チャー) という、新しいアッセイを開発します。
Abstract
銀ナノ粒子 (AgNPs) は、商業製品、繊維製品、化粧品、彼らの強力な抗菌効果のためのヘルスケア アイテムなどで広く使用されています。また、環境中に放出されることがあります、海に蓄積されます。したがって、AgNPs は銀汚染の主な原因で、Ag の環境毒性に対する国民の意識が増加しています。以前の研究は、(生産者) の蓄積と Ag の (消費者/捕食者) の倍率を示しています。クジラ、海の頂点捕食者として否定的に遭った Ag/銀化合物による。誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) による鯨類体内 Ag/銀化合物の濃度を測定できますが、ICP-MS の使用は資本コストが高いと組織にストレージを/準備の要件によって制限されます。したがって、autometallography (AMG) 法を用いた画像定量分析にホルマリン固定、suborgan レベルで Ag イオン分布をローカライズし、鯨で Ag 濃度を推定する補助メソッドがあります (FFPE) 組織のパラフィン包埋組織。AMG の肯定的な信号は主に近位尿細管上皮、肝細胞、クッパー細胞の細胞質で様々 なサイズの黒い顆粒に茶色です。時折、内腔といくつかの近位腎尿細管基底膜の茶色の AMG の肯定的な信号をいくつかの非晶質の黄金色が記載されています。Ag 濃度を推定するための試金、鯨組織 Ag の試金 (チャー)、AMG 法と誘導結合プラズマ質量の画像定量的解析からのデータによって設立された回帰モデルであるといいます。AMG をローカライズするチャーと半定量化重金属の使用は、時空とクロス種の研究の便利な方法を提供します。
Introduction
銀ナノ粒子 (AgNPs) は、商業製品、繊維製品、化粧品、その偉大な抗菌効果1,2のためのヘルスケア アイテムなどで広く使用されています。したがって、AgNPs、AgNP 含有製品の数の生産は時間3,4に増加しました。しかし、AgNPs は環境に放出される可能性があります、海5,6に蓄積されます。銀汚染の主要なソースとなっているし、Ag の環境毒性の国民の意識が増加しています。
海洋環境における AgNPs と銀の状態は複雑で絶えず変化します。以前の研究は、粒子、集計、溶解、化学種と反応や Ag+イオン7,8からを再生成すると AgNPs が残ることができることを示されています。銀化合物、塩化銀などのいくつかの種類は、海底堆積物、彼らが底生生物が摂取することができ、食物連鎖の9,10」と入力で発見されています。台湾の南西部の海岸に沿ってチー区ラグーン エリアで行われた以前の研究によると海底堆積物中の Ag 濃度が非常に低く、地殻の存在と同様、魚の肝臓組織の通常検出下(< 0.025 μ g/g ウェット ・ ウェット)11を制限します。ただし、さまざまな国で行われた以前の研究は、鯨類12,13の肝臓で比較的高い Ag 濃度を示しています。鯨類の肝における Ag 濃度は年齢に依存する自分の体で Ag のソースが最も可能性の高い彼らの獲物の12であることを示唆しています。さらにこれらの調査結果より高い栄養レベルで動物の Ag の biomagnification をお勧めします。クジラ、海、頂点捕食者として受けた可能性があります銀/銀化合物12,13,14によって引き起こされる負の健康への影響。クジラ目の動物のような最も重要なことは、人間では哺乳類、鯨類の銀/銀化合物によって引き起こされる影響がヒトでも発生する負の健康。つまり、鯨類は、sentinel 動物海洋環境および人間の健康のため可能性があります。したがって、健康への影響、組織分布、鯨類の銀の濃度は大きな関心事です。
誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) による鯨類体内 Ag/銀化合物の濃度が測れる、ICP-MS の使用 (楽器と保守)、高資本コストおよび組織のストレージの要件によって制限されます。/preparation12,15。さらに、通常物流の困難は、労働力の不足と関連リソース12の不足のため座礁鯨ケースのすべての調査で包括的な組織サンプルを収集することは困難です。誘導結合プラズマ質量分析のための凍結するティッシュ サンプルは、限られた冷凍スペースのため簡単に格納されず、壊れた冷凍機器12 のため凍結するティッシュ サンプルに破棄される可能性があります。これらの前述の障害は、凍結組織試料を用いた誘導結合プラズマ質量分析による鯨類の体内汚染レベルの調査を妨げます。対照的に、ホルマリン固定組織サンプルが比較的死者座礁鯨類の死体解剖の間に集めやすいです。そのため、ホルマリン固定組織サンプルを用いて鯨類体内重金属の検出/測定に使いやすい、安価な方法を開発する必要があります。
Suborgan 分布とアルカリ及びアルカリ土類金属の濃度は、ホルマリン固定中に変更される可能性があります、パラフィン (FFPE) プロセス、Ag などの遷移金属の低い効果だけは指摘した16をされています。したがって、FFPE 組織は金属および測定16,17理想的なサンプル リソースとして考えられています。Autometallography (AMG)、組織化学的プロセスは FFPE 切片の黒い AMG の肯定的な信号に可変サイズのゴールデン イエローとして重金属を増幅することし、光顕18,の下でこれらの増幅された重金属を視覚化できます。19,20,21します。 したがって、AMG メソッドは、重金属の suborgan 分布に関する情報を提供します。ICP-MS のみ臓器レベル18の重金属の濃度を測定できるので生物における重金属の代謝経路を研究するための重要な追加情報を提供できます。さらに、ImageJ など、デジタル画像分析ソフトウェアは、組織学的組織のセクション22,23の定量分析に適用されています。FFPE 切片の黒い AMG の肯定的な信号を可変サイズの黄金色を定量化し、重金属類の濃度を推定するために使用することができます。それを画像の定量的解析と ICP-MS、鯨の名前はから得られるデータに基づく回帰モデルによって推定できる画像定量解析を用いた AMG 法による絶対 Ag 濃度を直接判断できないが組織学的 Ag 試金 (チャー)。最も孤立した鯨類の誘導結合プラズマ質量分析法による Ag 濃度を測定の難しさを考慮したチャーは鯨類体内の不足のための誘導結合プラズマ質量分析によって確定できない Ag 濃度を推定する貴重な補助方法冷凍組織サンプル。Suborgan レベルと Ag の鯨類の肝臓と腎臓の組織内濃度を推定するチャーというアッセイで Ag のローカライズに関する組織化学的手法 (AMG 法) のプロトコルについて述べる。
図 1: Ag 濃度を推定するための確立と鯨類の組織学的 Ag 試金 (チャー) のアプリケーションを描いたフローチャート。チャー鯨類の組織学的な Ag の試金、FFPE を = = ホルマリン固定、パラフィン包埋、ICP-MS = 誘導結合プラズマ質量分析法。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
論文研究の目的は、suborgan レベルで Ag 分布を評価して Ag の鯨類の組織内濃度を推定する補助方法を確立することです。現在のプロトコルは、ICP-MS、知られている Ag 濃度とペアをマッチさせた組織試料の 2) AMG 分析 3) Ag 濃度を推定する回帰モデル (チャー) の確立による鯨類の組織 1) Ag 濃度の測定AMG の正の値、4) が精度とチャー、及び 5 の精度の評価) チャーによる Ag の推定濃度。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはサンプル コレクションとストレージ、台湾鯨社会、台北などの台湾日本鯨類のストランディング ネットワークに感謝します。鯨類研究所 (教授先取特権 Siang 周)、生態学研究所、進化生物学、国立台湾大学、台北。自然科学 (博士 Chiou じゅ八尾)、台中; 国立博物館海洋生物学・日本鯨類研究所国立チェン Kung 大学。我々 はまた彼らの許可の林業局、農業委員会、行政院を感謝します。
Materials
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | — | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
Riferimenti
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