Reconstitution du cycle cellulaire Oscillations Microemulsions des extraits d’oeufs acellulaire Xenopus
Summary
Nous présentons une méthode pour la production d’in vitro auto-entretenue oscillations mitotique au niveau unicellulaire en encapsulant les extraits d’oeufs de Xenopus laevis dans eau-dans-huile microémulsions.
Abstract
Mesure en temps réel des oscillations au niveau unicellulaire est important afin de découvrir les mécanismes de l’horloge biologique. Bien que les extraits en vrac préparés à partir d’oeufs de Xenopus laevis ont été puissantes en disséquant les réseaux biochimiques sous-jacentes de la progression du cycle cellulaire, leur mesure moyenne de l’ensemble mène habituellement à une oscillation amortie, en dépit de chacun chaque oscillateur étant maintenue. C’est en raison de la difficulté d’une synchronisation parfaite entre les oscillateurs individuels dans les systèmes biologiques bruyants. Pour récupérer la dynamique de cellules individuelles de l’oscillateur, nous avons développé un système de cellule artificielle axée sur les gouttelettes qui peut reconstituer les cycles mitotiques dans les compartiments alvéolaire encapsulant cyclisme extraits cytoplasmiques des oeufs de Xenopus laevis . Ces cellules cytoplasmiques seule simples pièce oscillations soutenues pendant plus de 30 cycles. Pour construire des cellules plus complexes avec des noyaux, nous avons ajouté la chromatine de sperme demembranated pour déclencher des noyaux auto-assemblage dans le système. Nous avons observé une évolution périodique du chromosome condensation/décondensation et noyaux enveloppent ventilation/reformation, comme de véritables cellules. Cela indique que l’oscillateur mitotique fonctionne fidèlement pour piloter plusieurs événements mitotiques en aval. En même temps, nous avons suivi la dynamique de l’oscillateur mitotique et des processus en aval dans les gouttelettes individuels à l’aide de la microscopie en fluorescence Time-lapse multicanaux. Le système cell-cycle artificiel fournit un cadre de haut-débit pour manipulation quantitative et l’analyse des oscillations mitotiques résolution unicellulaire, qui probablement fournit des renseignements importants sur les mécanismes réglementaires et les fonctions de l’horloge.
Introduction
Extraits cytoplasmiques, préparés à partir d’oeufs de Xenopus laevis représentent un des modèles plus prédominants pour l’étude biochimique des cycles cellulaires, étant donné le volume important d’ovocytes, la progression du cycle cellulaire rapide et la capacité de reconstitution événements mitotique in vitro1,2. Ce système a permis la découverte initiale et la caractérisation mécaniste des régulateurs de cycle cellulaire essentiel comme facteur favorisant la maturation (MPF) ainsi que des processus mitotiques en aval, y compris la broche Assemblée et chromosome ségrégation1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Les extraits d’oeufs de Xenopus ont également été utilisés pour la dissection détaillée des réseaux de régulation du cycle cellulaire horloge8,12,13,14 et pour les études sur les lésions de l’ADN /Replication checkpoint15 et le fuseau mitotique Assemblée checkpoint16,17,18.
Ces études de cycles cellulaires en utilisant les extraits d’oeufs de Xenopus reposent principalement sur des mesures en vrac. Cependant, tests de réaction classique en vrac ne peuvent pas imiter des comportements de cellule réelle, étant donnés un écart important dans leurs dimensions et la compartimentation spatiale subcellulaire de molécules de réaction. En outre, en vrac les mesures d’activité mitotique sont sujettes à donner un nombre limité de cycles avant amortissement rapidement8. Ces inconvénients de réactions en vrac ont empêché le système extrait pour approfondir la compréhension des fonctions et des propriétés dynamiques complexes horloge. Des études récentes ont encapsulé acellulaire cytostatique (CSF) de facteur-arrêté Xenopus extrait19,20 dans alvéolaire compartiments taille définie, qui ont contribué à élucider comment taille broche est modulée par la volume cytoplasmique. Cependant, ce système in vitro est arrêté à la métaphase de la méiose II par l’action du facteur cytostatique1, et un système capable des oscillations soutenues à long terme au niveau de la cellule unique est nécessaire pour une enquête plus approfondie du cycle cellulaire oscillateur.
Afin d’étudier les oscillations du cycle cellulaire avec une cellule unique résolution, nous avons développé une échelle cellulaire, système de haut-débit pour la reconstitution et la mesure simultanée de plusieurs processus auto-entretenu d’oscillatoires mitotiques en microémulsion individuelle gouttelettes. Dans ce protocole vidéo détaillé, nous démontrons la création du système d’oscillation mitotique artificiel en encapsulant cyclisme cytoplasme d’oeufs de Xenopus laevis dans micro-émulsions de tailles allant de 10 à 300 µm. Dans ce système, les oscillations mitotiques y compris la condensation des chromosomes et dé-condensation, ventilation de l’enveloppe nucléaire et réforme et la dégradation et synthèse des substrats de l’anaphase (p. ex., securin-mCherry dans le présent protocole) ont été reconstitué avec succès.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté une nouvelle méthode pour développer un système de cellule artificielle haut débit cette reconstitution in vitro permet et le suivi à long terme des oscillations auto-entretenue cycle cellulaire au niveau de single-cell. Il y a plusieurs étapes critiques qui font de cette méthode avec succès. Oeufs de Xenopus tout d’abord, fraîchement pressés avec une bonne qualité, comparativement aux œufs, ont tendance à produire des extraits avec activité d’oscillation de plus …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Madeleine Lu pour construire le plasmide securin-mCherry, Lap homme Lee, Kenneth Ho et Allen P Liu pour les discussions sur la génération de la gouttelette, Jeremy B. Chang et James E. Ferrell Jr permettant de que construire des GFP-NLS. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (Early CAREER Grant #1553031), le National Institutes of Health (MIRA #GM119688) et une bourse de recherche de Sloan.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
Riferimenti
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