שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית
Summary
אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.
Abstract
בזמן אמת מדידה של תנודות ברמת תא בודד חשוב לחשוף את המנגנונים של שעונים ביולוגיים. למרות תמציות בצובר להכין מביצים צפרדע רפואית זריזה היה חזק בניתוח רשתות הביוכימי שבבסיס את התקדמות מחזור התא, מדידה הממוצע שלהם אנסמבל בדרך כלל מוביל לאי תנודה לח, למרות כל אחד מתנד בודדים עם השיתופן. זאת בשל הקושי של סנכרון מושלם בין מתנדים בודדים במערכות ביולוגיות רועש. כדי לאחזר את הדינמיקה תא בודד של מתנד, פיתחנו מערכת מבוססת-droplet תא מלאכותיים יכולים לשקם מחזורים mitotic בתאים קטנים לבצע רכיבת אופניים cytoplasmic תמציות של צפרדע רפואית זריזה ביצים. תאים פשוטים אלה cytoplasmic בלבד התערוכה תנודות ממושכת מעל 30 מחזורים. כדי לבנות יותר מסובך תאים עם גרעינים, הוספנו demembranated כרומטין הזרע כדי לעורר את הגרעינים הרכבה עצמית במערכת. הבחנו התקדמות תקופתיים של כרומוזום עיבוי/decondensation, גרעינים אופפים התמוטטות/הרפורמציה, כמו תאים אמיתיים. אפשרות זו מציינת כי מתנד mitotic מתפקד בנאמנות להסיע מספר אירועים mitotic במורד הזרם. במקביל איתרנו את הדינמיקה של מתנד mitotic ואת התהליכים במורד הזרם droplets בודדים באמצעות מיקרוסקופ רב ערוצית זריחה זמן לשגות. מערכת מחזור התא המלאכותי מספק מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותיים וניתוח של תנודות mitotic עם רזולוציה מתא בודד, אשר סביר להניח מספק תובנות חשובות מכונות רגולטוריות והפונקציות של השעון.
Introduction
תמציות cytoplasmic להכין מביצים זריזה צפרדע רפואית מייצג אחד המודלים הדומיננטית ביותר לחקר התא מחזורים, נתון הכמות הגדולה של oocytes, את התקדמות מהירה מחזור התא, את היכולת לשחזר הביוכימי אירועים mitotic במבחנה1,2. מערכת זו אפשרה את התגלית הראשונית ואפיון מכניסטית של מחזור התא חיוני הרגולטורים, כמו קידום ההבשלה פקטור (MPF), כמו גם התהליכים mitotic במורד הזרם, כולל ציר סגרגציה הרכבה של כרומוזום1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. תמציות ביצה צפרדע רפואית גם שימשו עבור ניתוח מפורט של רשתות רגולטוריות של מחזור התא שעון8,12,13,14 , מחקרים של נזק לדנ א מחסום /replication15 , פלך mitotic הרכבה מחסום16,17,18.
מחקרים אלה מחזורי תאים באמצעות תמציות ביצה צפרדע רפואית בעיקר התבססו על מדידות בצובר. עם זאת, התגובה בצובר קונבנציונאלי מבחני עשוי לא לחקות התנהגויות תא אמיתי, בהתחשב פער גדול הממדים שלהם, subcellular מידור המרחבי של מולקולות התגובה. יתר על כן, מדידות בכמות גדולה של פעילויות mitotic נוטים לתת מספר מוגבל של מחזורים לפני דעיכת במהירות8. החסרונות של תגובות בצובר למנוע את תמצית למערכת לספק נוסף להבנה של מאפיינים דינאמי שעון מורכבים ופונקציות. מחקרים שנעשו לאחרונה יש אנקפסולציה ללא תא cytostatic בבידוד-פקטור (CSF) צפרדע רפואית תמציות19,20 לתוך מוגדרת על-ידי גודל תא דמוי מדורים, סייעו להבהיר איך לגודל צירים הוא מווסת על ידי נפח cytoplasmic. עם זאת, מערכת זו במבחנה נעצר בשדה מפה של מיוזה II על ידי הפעולה של גורם cytostatic1, מערכת מסוגלת לטווח ארוך מתמשכת תנודות ברמת התא היחיד שנדרש לחקירה נוספת של מחזור התא מתנד.
ללמוד מחזור התא תנודות ברזולוציה של תא בודד, פיתחנו של התא-סולם, מערכת תפוקה גבוהה למפת המדידה בו זמנית מספר תהליכי מתנדנדות עצמית מתמשכת mitotic microemulsion בודדים טיפות. בפרוטוקול זה וידאו מפורט, נדגים על הקמת מערכת תנודה mitotic מלאכותי על ידי לבצע רכיבת אופניים הציטופלסמה ביצה זריזה צפרדע רפואית ב microemulsions בגדלים החל מ 10 מיקרומטר 300. במערכת זו, היו תנודות mitotic כולל כרומוזום עיבוי, דה-עיבוי, התמוטטות מעטפת הגרעין, הרפורמציה, השפלה ואת סינתזה של סובסטרטים “אנאפאזה” (למשל, securin-mCherry ב פרוטוקול זה) בהצלחה מחדש.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוצגו שיטה לפיתוח מערכת תפוקה גבוהה התא המלאכותי הזה מאפשר חוץ גופית בתוך שיחזור ומעקב לטווח ארוך של מחזור התא עצמית מתמשכת תנודות ברמת תא בודד. ישנם מספר שלבים קריטיים, ההופכות שיטה זו מוצלחת. ביצים צפרדע רפואית הראשון, סחוט טרי באיכות טובה, בהשוואה עם ביצים הניח, נוטים לייצר תמצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לו מדלן על בניית פלסמיד securin-mCherry, הברכיים Man Lee, קנת הו, אלן ליו P לדיונים על יצירת droplet, ג’רמי B. צ’אנג, ג’יימס דגלס פרל ג’וניור למתן ש-GFP-NLS לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (הקריירה המוקדמת מענק #1553031), מכוני הבריאות הלאומיים (מירה #GM119688), מלגת מחקר סלואן.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
