إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو
Summary
نقدم وسيلة لتوليد في المختبر مكتفية ذاتيا ذبذبات الانقسامية على مستوى خلية واحدة بتغليف البيض مقتطفات من النمو لإيفيس في ميكرومولسيونس الماء في النفط.
Abstract
المهم قياس ذبذبات على مستوى خلية واحدة في الوقت الحقيقي لكشف آليات الساعات البيولوجية. رغم مقتطفات جل إعداد من البيض ليفيس النمو القوية في تشريح الشبكات الحيوية الكامنة وراء تطور دورة الخلية، قياس متوسط الفرقة عادة ما يؤدي إلى التذبذب ثبط، على الرغم من كل مذبذب الفردية التي لحقت. وهذا نظراً لصعوبة تزامن مثالي بين التذبذب الفردية في الأنظمة البيولوجية صاخبة. لاسترداد ديناميات خلية واحدة المذبذب، قمنا بتطوير نظام المستندة إلى الحبرية خلية اصطناعية التي يمكن إعادة تشكيل دورات الانقسامية في المقصورات الخليوي تشبه تغليف مقتطفات هيولى ركوب البيض ليفيس النمو . هذه الخلايا هيولى فقط بسيط يحمل ذبذبات مستمرة لما يزيد على 30 من دورات. لبناء خلايا أكثر تعقيداً مع نويات، أضفنا الكروماتين الحيوانات المنوية ديميمبراناتيد لتحريك نويات التجميع الذاتي في النظام. لاحظنا تقدم دوري كروموسوم التكثيف/ديكوندينسيشن ونوى يطوق انهيار/الإصلاح، مثل في الخلايا الحقيقية. يشير هذا إلى أن المذبذب الانقسامية وظائف أمانة محرك أقراص متعددة الأحداث الانقسامية المتلقين للمعلومات. ونحن في نفس الوقت تعقب ديناميات مذبذب الانقسامية وعمليات المصب في قطرات الفردية باستخدام مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين متعدد القنوات. نظام دورة الخلية الاصطناعية يوفر إطارا الفائق للتلاعب بالكمية وتحليل ذبذبات الانقسامية مع القرار خلية واحدة، مما يرجح أن يوفر معلومات هامة بشأن الآلية التنظيمية ووظائفها على مدار الساعة.
Introduction
مقتطفات هيولى إعداد من البيض ليفيس النمو تمثل أحد النماذج الأكثر الغالبة لدراسة الكيمياء الحيوية لدورة الخلية، نظراً لكبر حجم بويضات، والتقدم السريع في دورة الخلية، والقدرة على إعادة تشكيل أحداث الانقسامية في المختبر1،2. هذا النظام قد أتاح اكتشاف الأولية وتوصيف آليا لمنظمي دورة الخلية الأساسية مثل مغزل عامل تشجيع النضج (MPF) فضلا عن العمليات الانقسامية المتلقين للمعلومات بما في ذلك الفصل بين الجمعية وكروموسوم1 ،2،3،4،5،،من67،،من89،10، 11. مقتطفات البيض النمو استخدمت أيضا لتشريح مفصل للشبكات التنظيمية لدورة الخلية على مدار الساعة8،،من1213،14 ودراسات عن أضرار الحمض النووي /replication حاجز15 والمغزل التفتلي الجمعية حاجز16،،من1718.
هذه الدراسات من دورات الخلية باستخدام مقتطفات البيض النمو أساسا قد تم استناداً إلى قياسات السائبة. ومع ذلك، فحوصات رد فعل الجملة التقليدية قد تقليد سلوكيات الخلية الحقيقية، نظراً لاختلاف رئيسي في الأبعاد والتقسيم المكاني سوبسيلولار من جزيئات رد فعل. وعلاوة على ذلك، هم عرضه لإعطاء عدد محدود من دورات قبل التخميد بسرعة8قياسات الجزء الأكبر من الأنشطة الانقسامية. هذه العيوب من ردود فعل معظم حالت دون نظام استخراج لتوفير مزيد من فهم الخصائص الديناميكية المعقدة على مدار الساعة ووظائفها. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد مغلفة تثبيط الخلايا الخلية الحرة (CSF) القبض على عامل النمو مقتطفات19،20 في أماكن مثل الخلية تعريف الحجم، التي ساعدت في توضيح كيف هو حجم الدوران عن طريق التضمين حجم هيولى. بيد أن هذا النظام في المختبر هو القبض على الطورية من الانقسام الاختزالي الثاني بفعل العوامل القاتلة1ويلزم وجود نظام قادر على ذبذبات المطرد طويل الأجل على مستوى خلية واحدة لإجراء مزيد من التحقيقات لدورة الخلية مذبذب.
دراسة ذبذبات دورة الخلية مع القرار خلية واحدة، وقد وضعنا على نطاق الخلية، النظام الفائق لقياس المتزامن لعدة عمليات متذبذبة الانقسامية مكتفية ذاتيا في ميكرومولسيون الفردية وإعادة تشكيل قطرات. في هذا البروتوكول فيديو مفصلة، نبدي إنشاء نظام التذبذب الانقسامية الاصطناعية بتغليف ليفيس النمو ركوب البيض السيتوبلازم في ميكرومولسيونس بأحجام تتراوح بين 10 إلى 300 ميكرون. وفي هذا النظام، كانت ذبذبات الانقسامية، بما في ذلك التكثيف كروموسوم والتكثيف دي، وانهيار المغلف النووية واصلاحهم، وتدهور والتوليف من ركائز طور الصعود (مثلاً، سيكورين-مشري في هذا البروتوكول) أعيد تشكيلها بنجاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قدمنا طريقة جديدة لوضع نظام خلية اصطناعية الفائق أن تمكن المختبر في إعادة تشكيل وتتبع ذبذبات دورة الخلية الاكتفاء الذاتي على مستوى خلية واحدة طويلة الأجل. وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تجعل هذا الأسلوب الناجح. أولاً، الطازج البيض النمو مع نوعية جيدة، بالمقارنة مع الب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر لو مادلين لتشييد بلازميد مشري سيكورين، لي مان اللفة والن ف ليو للمناقشات حول الجيل الحبرية وجيريمي باء تشانغ وهو كينيث جيمس هاء فيريل الابن لتوفير بناء بروتينات فلورية خضراء-NLS. هذا العمل كان تدعمها “المؤسسة الوطنية للعلوم” (الوظيفي المبكر منحة #1553031)، المعاهد الوطنية للصحة (ميرا #GM119688)، وزمالة أبحاث سلون.
Materials
| Xenopus laevis frogs | Xenopus-I Inc. | ||
| QIAprep spin miniprep kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | QIAGEN | 28106 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| BL21 (DE3)-T-1 competent cell | Sigma-Aldrich | B2935 | |
| Calcium ionophore | Sigma-Aldrich | A23187 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Toxic |
| Trichloro | Sigma-Aldrich | 448931 | Toxic |
| (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane | |||
| PFPE-PEG surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads | Sigma-Aldrich | GE17-0756-01 | |
| PD-10 column | Sigma-Aldrich | GE17-0851-01 | |
| VitroCom miniature hollow glass tubing | VitroCom | 5012 | |
| Olympus SZ61 Stereo Microscope | Olympus | ||
| Olympus IX83 microscope | Olympus | ||
| Olympus FV1200 confocal microscope | Olympus | ||
| NanoDrop spectrophotometer | Thermofisher | ND-2000 | |
| 0.4 mL Snap-Cap Microtubes | E&K Scientific | 485050-B | |
| PureLink RNA Mini Kit | ThermoFisher（Ambion） | 12183018A | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Imaris | Bitplane | Version 7.3 | Image analysis software |
References
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
- Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
- Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
- Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
- Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
- Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
- Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
- Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
- Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
- Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
- Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
- Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Wilson, C. M. . Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).
- Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
- Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
- Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
- Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).
