Этот протокол предоставляет метод для оценки протеолитической активности протеаз неразрывно низкой активности, один оборот в сотовой связи. В частности этот метод применяется для оценки протеолитической активности PCSK9, ключевым фактором липидного обмена, чьи протеолитической активности требуется для его конечной употреблением функции.
Proprotein конвертазы Субтилизин/kexin тип 9 (PCSK9) — сингл оборот протеазы, который регулирует сыворотке крови липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и, следовательно, сердечно-сосудистых заболеваний. Хотя PCSK9 Протеолиз требуется для его полной повышенным эффектом, оценки его протеолитического функции сложной: PCSK9 известна только само прилепится, проходит только один оборот и после протеолиза, сохраняет ее субстрат в ее активные сайт как auto ингибитора. Представленные здесь методы описывают assay который преодолевает эти проблемы. Assay фокусируется на межмолекулярных протеолиза в ячейки на основе контекста и успешных расщепления ссылки секретируемые Люцифераза деятельности, которые могут быть легко прочитаны в среде с кондиционерами. Через последовательные шаги мутагенеза, переходных transfection и индикация Люцифераза, assay может зонд PCSK9 Протеолиз в условиях либо генетических и молекулярных возмущений в духе высокой пропускной способности. Эта система хорошо подходит для обоих биохимической оценки клинически выявленных Миссенс сингл-полиморфизмы нуклеотидов (ОНП), а также что касается скрининга мелкомолекулярных ингибиторы протеолиза PCSK9.
PCSK9 цели рецепторов ЛПНП (ЛПНП-R) для деградации, поднимая LDL холестерина (LDL-C) и вождения атеросклеротического заболевания сердца1,2. Терапии таргетинга PCSK9 решительно снизить LDL-C и улучшить сердечно-сосудистые исходы для пациентов, даже при добавлении агрессивный липидов понижая терапии статинами3,4. Однако, в настоящее время утвержденных терапии ограничены подходы на основе антител и страдают от отсутствия экономичности5,6. Чтобы решить эту проблему, необходимы менее дорогостоящим терапевтической альтернативы, средства для выявления больных, скорее всего получить более значительные выгоды, или оба.
Мелкомолекулярных подходы могут целевых внутриклеточных PCSK9, обеспечивают улучшение маршрут администрации и сокращения расходов, что делает их «Святой Грааль» в этой области7. Однако PCSK9 оказалось трудно наркотиков в малых молекул. Как протеазы ориентация протеолитических функция PCSK9 является привлекательной стратегией, как self протеолиза тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания8 и является обязательным для максимального эффекта на ЛПНП-R9. На сегодняшний день, однако, эта стратегия не удалось, вероятно из-за PCSK9 в уникальный биохимии: PCSK9 расщепляет только сам10, выполняя один оборот реакции, и после self расщепление, остается связанным на активном узле как PCSK9 prodomain Авто ингибитор11, предотвращая индикация любой дальнейшей активности протеаз.
Эта статья представляет метод для оценки PCSK9 протеолитической функция в высок объём моды8. Через сайт направленного мутагенеза следователи можно использовать этот assay зонда эффекты кодирования ОНП в клинике для оценки их воздействия на протеолиза, тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания. Кроме того этот метод будет полезна в разработке экранов высокой пропускной способностью для выявления модуляторы протеолиза PCSK9, которые, как ожидается, в конечном итоге сорвать презентация PCSK9 ЛПНП-r (и модулировать PCSK9 повышенным эффектом) . Наконец этот протокол может быть адаптирована к другим протеаз с неразрывно низкая активность, условии, что i) конкретного субстрата протеазы пара можно найти, и ii) привязку подходящего внутриклеточных могут быть установлены для субстрата.
Описанные выше экспериментальной процедуры представляют способ преодолеть неразрывно низкой активности протеаз сингл оборот PCSK9 и оценить его протеолитического функция на надежной основе. Ключевая концепция assay полагается на преобразования одного оборота событий в ферментационно и…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят щедрой финансовой поддержке NHLBI/низ (K08 HL124068 и LRP HMOT1243), NCATS/низ через UCSF клинических и поступательного науки Института катализатор программы (УЛ1 TR000004), UCSF академического Сената, Хеллман фонд, Галааде наук исследования ученый премии, Pfizer ASPIRE сердечно-премии, (все для Джон S. чорба) и Говард Хьюз медицинский институт (до Galvan Adri м. и. м. Шокат Кеван).
PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Autori | n/a | Available from authors |
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Autori | n/a | Available from authors |
Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
(+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |