Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9
Summary
Dit protocol biedt een methode om te evalueren van de proteolytic activiteit van een intrinsiek laag-activiteit, één omzet protease in een cellulaire context. In het bijzonder is deze methode toegepast om te evalueren van de proteolytic activiteit van PCSK9, een belangrijke bestuurder van lipide metabolisme waarvan proteolytic activiteit vereist voor de ultieme hypercholesterolemic functie is.
Abstract
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is een single-omzet protease die serum low-density lipoprotein (LDL) niveaus regelt en, bijgevolg, hart-en vaatziekten. Hoewel PCSK9 proteolyse vereist voor het volledige hypercholesterolemic effect is, de evaluatie van zijn proteolytische functie is uitdagend: PCSK9 is alleen bekend dat het klieven zelf, ondergaat slechts een enkele omzet, en na proteolyse, behoudt zijn substraat in de actieve site als een auto-remmer. De hier gepresenteerde methoden beschrijven een bepaling die deze uitdagingen overwint. De test richt zich op intermoleculaire proteolyse in een cel-gebaseerde context en de succesvolle decollete koppelingen aan de secreted luciferase activiteit, die kan gemakkelijk worden voorgelezen in het geconditioneerde medium. Via opeenvolgende stappen van mutagenese, voorbijgaande transfectie en een luciferase uitlezing, de bepaling kan sonde PCSK9 proteolyse onder voorwaarden van genetische of moleculaire perturbation in zodanig hoge gegevensdoorvoer. Dit systeem is geschikt voor zowel de biochemische evaluatie van klinisch ontdekte missense single-nucleotidepolymorfisme (SNPs), alsook wat betreft de screening van kleine-molecuul remmers van PCSK9 proteolyse.
Introduction
PCSK9 richt de LDL-receptor (LDL-R) voor afbraak, verhoging van LDL cholesterol (LDL-C) en rijden atherosclerotische hart-en vaatziekten1,2. Therapeutiek targeting PCSK9 krachtig lagere LDL-C en verbeteren van cardiovasculaire uitkomsten voor patiënten, zelfs wanneer toegevoegd aan een agressieve lipide-verlagende therapie met statines3,4. Momenteel goedgekeurde therapieën zijn beperkt tot antilichaam-gebaseerde benaderingen, echter, en lijden onder een gebrek aan kosteneffectiviteit5,6. U kunt dit probleem oplossen, zijn minder dure therapeutische alternatieven, een middel om het identificeren van patiënten kunnen profiteren van meer voordelen, of beide, nodig.
Kleine-molecuul benaderingen kunnen richten intracellulaire PCSK9, bieden een betere wijze van toediening en kostenverlaging, waardoor ze de “Heilige Graal” in dit gebied7. PCSK9 heeft echter bewezen moeilijk te drug door kleine moleculen. Als een protease is gericht op PCSK9 van Proteolytische functie een aantrekkelijke strategie, zoals zelf-proteolyse de snelheidslimieten stap in de PCSK9 maturatie8 is en vereist voor het maximale effect op de LDL-R9 is. Tot op heden echter deze strategie niet geslaagd, waarschijnlijk als gevolg van de PCSK9 van unieke biochemie: PCSK9 cleaves alleen zelf10, uitvoeren van een reactie van single-omzet, en na zelf-decolleté, de PCSK9 prodomain blijft gebonden in de actieve site als een auto-remmer11, voorkomen van de uitlezing van elke verdere protease-activiteit.
Dit artikel presenteert een methode om te evalueren van de Proteolytische functie PCSK9 in high-throughput mode8. Via plaats-geleide mutagenese, kunnen onderzoekers deze test gebruiken om de effecten van codering SNPs gevonden in de kliniek om te beoordelen voor effecten op proteolyse, de snelheidslimieten stap van PCSK9 rijping sonde. Bovendien, zal deze methode nuttig zijn in het ontwerp van hoge-doorvoer schermen te identificeren modulatoren van PCSK9 proteolyse, die worden verwacht om uiteindelijk het verstoren van de presentatie van PCSK9 de LDL-r (en moduleren van PCSK9 van hypercholesterolemic effect) . Ten slotte kan dit protocol worden aangepast aan andere proteasen met intrinsiek lage activiteit, mits i) een paar specifieke substraat-protease kan worden gevonden, en ii) een geschikt intracellulaire anker voor het substraat kan worden vastgesteld.
Protocol
Representative Results
Discussion
De experimentele procedures die hierboven beschreven presenteer een methode om te overwinnen de intrinsiek lage activiteit van de single-omzet protease PCSK9 en zijn proteolytische functie wordt geëvalueerd in een robuuste manier. Het sleutelbegrip van de bepaling is gebaseerd op het omzetten van een single-omzet-evenement in een enzymatisch versterkte uitlezing. De sterke punten van de bepaling zijn de relatief korte tijd-frame en gebruiksgemak van de luciferase verslaggever, evenals haar schaalbaarheid voor high-throu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de gulle financiële steun van de NHLBI/NIH (K08 HL124068 en LRP HMOT1243), NCATS/NIH via de UCSF klinisch en translationeel Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), de UCSF academische Senaat, de Hellman Foundation, een Gilead Sciences Research Scholar Award, een Pfizer ASPIRE cardiovasculaire Award (alles aan John S. Chorba) en het Howard Hughes Medical Institute (aan Adri M. Galvan en Kevan M. Shokat).
Materials
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | For PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (for PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Autori | n/a | Available from authors |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Autori | n/a | Available from authors |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | For DNA gels |
| E-Gel Imager System with Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | For imaging DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | For DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | For DNA gel running buffer |
| Glacial acetic acid | ThermoFisher Scientific | A38-500 | For DNA gel running buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, for DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriction enzyme |
| LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb plates |
| One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemically competent cells |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selective antibiotic |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Purification Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrophotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrophotometer |
| 293T Cells | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cells |
| DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, mammalian cell media |
| Fetal Bovine Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, for cell dissociation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automated cell counting |
| Countess cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides for cell counting |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid | Grenier Bio-One | 655083 | White, white-bottom 96 well plate |
| TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural | USA Scientific | 1402-9596 | 96 well plate for master plasmid plate |
| Nunc 2.0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 well deep well plate |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipid transfection reagent, Lf3K |
| P3000 Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced serum medium for transfection |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Millipore Sigma | A4034 | Sodium ascorbate |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Hydrochloric acid | VWR | JT9535-2 | Concentrated HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substrate |
| Syringe Filter, Sterile | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multichannel pipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multichannel pipette |
| Reagent reservoir | Corning | 4870 | Trough for reagents |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 for Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific data analysis software |
Riferimenti
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
- Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
- Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
- Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
- Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
- Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 – A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
- Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
- Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
- Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
- Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
- Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
- Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).
