Summary
Ce protocole présente une méthode simple en deux étapes afin de différencier les cellules souches épithéliales cornéennes limbique de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent une production rentable, à grande échelle des cellules qualité clinique applicables à l’utilisation de la thérapie des cellules cornéenne.
Abstract
Cellules souches épithéliales limbique cornée (LESCs) sont responsables de la renouveler en permanence l’épithélium cornéen et maintenant ainsi l’homéostasie cornéenne et une clarté visuelle. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-LESCs dérivées fournissent une source prometteuse de la cellule pour la thérapie de remplacement de cellules cornéennes. Conditions de culture et de la différenciation indéfinies, xénogéniques provoquent des variations dans les résultats de la recherche et entravent la traduction clinique de produits thérapeutiques dérivés de hPSC. Ce protocole prévoit une méthode reproductible et efficace pour la différenciation hPSC-LESC conditions xeno - et chargeur acellulaire. Tout d’abord, culture monocouche de hPSC indifférenciée sur recombinant laminin-521 (LN-521) et moyen défini hPSC sert de base pour une production robuste de haute qualité de matière première pour des différenciations. Deuxièmement, une méthode de différenciation rapide et simple hPSC-LESC donne des populations LESC en seulement 24 jours. Cette méthode comprend une induction surface ectodermique de quatre jours en suspension avec des petites molécules, suivie par phase de culture adhérent sur matrice de combinaison de LN-521/collagène IV dans un milieu défini différenciation épithéliale cornéenne. Cryostoring prolongée différenciation purifie la population cellulaire et permet aux banques de cellules de grandes quantités de produits de thérapie cellulaire. Les qualité qui en résulte hPSC-LESCs fournissent une stratégie de nouveau traitement potentiel pour la reconstruction de surface cornéenne traiter l’insuffisance limbique des cellules souches (LSCD).
Introduction
La cornée transparente à la surface oculaire permet à la lumière d’entrer dans la rétine et fournit la majorité du pouvoir de réfraction de le œil. La couche la plus externe, l’épithélium cornéen stratifié, est continuellement régénérée par les cellules souches épithéliales limbique (LESCs). Les LESCs se trouvent dans la couche basale des niches limbique à la jonction de corneoscleral1,2. LESCs n’ont pas des marqueurs spécifiques et uniques, donc leur identification nécessite une analyse plus approfondie d’un ensemble de marqueurs putatifs. Épithéliales transcription factor p63 et surtout en position N-terminale tronquée transcription de l’isoforme alpha de p63 (ΔNp63α), a été proposé comme une pertinente positive LESC marqueur3,4. Une répartition asymétrique des LESCs permet à se renouveler, mais également produire la progéniture qui migrent de façon centripète et vers l’avant. Comme les cellules des progrès vers la surface de la cornée ils progressivement perdre leurs stemness et enfin faire la différence en phase terminale à des cellules malpighiennes superficielles qui sont constamment perdus de la surface de la cornée.
Dommages à l’une des couches cornéens peuvent mener à la déficience visuelle grave, et défauts cornéens sont donc une des principales causes de cécité dans le monde entier. Dans insuffisance limbique des cellules souches (LSCD), le limbe est détruite par une maladie ou un traumatisme qui mène à conjunctivalization et opacification de la surface de la cornée et la perte de vision5,6. Thérapie de remplacement de cellules à l’aide de greffes limbique autologues ou allogéniques propose une stratégie thérapeutique pour les patients atteints LSCD4,7,8,9. Toutefois, récolte des greffes autologues porte un risque de complications à le œil sain et tissu du donneur est en bref l’approvisionnement. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), spécifiquement les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), peut servir comme une source illimitée de types de cellules cliniquement pertinents, y compris les cellules épithéliales cornéennes. Par conséquent, LESCs dérivé de hPSC (hPSC-LESCs) représentent une source de cellule nouveau attrayant pour la thérapie de remplacement de cellules oculaires.
Traditionnellement, des méthodes de culture hPSC indifférencié et leurs protocoles de différenciation à LESCs sont sont appuyés sur l’utilisation de cellules nourricières indéfini, sérums animaux, milieux conditionnés ou membranes amniotiques10,11, 12 , 13 , 14 , 15. récemment, les efforts vers des produits de thérapie cellulaire plus sûrs ont incité la recherche de plusieurs protocoles standardisés et xeno sans la culture et de la différenciation. Par conséquent, plusieurs méthodes définies et xeno-gratuit pour les cultures à long terme des hPSCs indifférencié sont maintenant disponibles dans le commerce16,17,18. Comme un continuum, différenciation dirigée en s’appuyant sur de hPSCs sort épithéliale cornéenne, les repères moléculaires des protocoles ont été récemment introduits19,20,21,22, 23. Encore bon nombre de ces protocoles utilisés soit hPSCs chargeur basé indéfini, comme matériau, ou des cocktails complexes, xénogéniques facteur de croissance pour la différentiation de départ.
Le but du présent protocole est de fournir un robuste et optimisé, xeno- et méthode de culture exempte d’alimentation hPSC et différenciation ultérieure à LESCs cornéens. Culture monocouche de pluripotentes hPSCs sur laminin-521 (LN-521) matrice dans un milieu défini, sans albumine hPSC (notamment essentiels 8 Flex) permet la production rapide de matière homogène de différenciations. Par la suite, un simple, stratégie de différenciation en deux étapes Guide hPSCs vers la surface ectodermique sort en suspension, suivie de différenciation adhérente à LESCs. Une population de cellules où > 65 % express ΔNp63α est obtenue dans les 24 jours. La xéno - et chargeur-un protocole d’entente a été testé avec plusieurs lignes de hPSC (CSEh et hiPSCs), sans aucune obligation pour l’optimisation spécifique de la cellule ligne. Les protocoles pour le week-end-gratuit maintenance, passage, cryostoring et hPSC-LESC phénotypage décrits ici permettent la production d’importants lots de qualité LESCs pour clinique ou des fins de recherche.
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Protocol
Université de Tampere a l’approbation de l’autorité nationale pour les affaires médico-légales Finlande (Dnro 1426/32/300/05) de mener des recherches sur les embryons humains. L’Institut a également des déclarations de soutien du Comité éthique du District hospitalier de Pirkanmaa dérivent, culture, et de différentier les lignées de CSEh (Skottman/R05116) et d’utiliser les lignes de hiPSC dans la recherche ophtalmique (Skottman/R14023). Aucune nouvelles lignées de cellules ont été calculées pour cette étude.
Remarque : Le protocole décrit est issu des hPSC spécifique, disponible dans le commerce et les médias de différenciation de l’épithélium cornéen. Veuillez vous référer à la Table des matières pour les numéros de catalogue et les informations de fabricant/fournisseur.
1. établir hPSC Xeno - et Feeder-free Culture
- Préparations
- Enduire plaques 24 puits avec humaine recombinante laminin-521 (LN-521). Pour le premier passage (FF) exempte d’engraissement, utilisez LN-521 à une concentration de 1,09 µg/cm2et à 0.55 µg/cm2 pour les passages suivants. Les concentrations de LN-521 suggérées servent comme point de départ pour la culture réussie de FF mais peuvent être abaissées.
- Décongeler le flacon de LN-521 lentement à 4 ° C selon les instructions du fabricant.
NOTE : Solution de LN-521 convenablement manipulée peut-être être conservée à 4 ° C jusqu'à 3 mois après décongélation. - Pour préparer la solution de revêtement, diluer la quantité appropriée de la solution mère de LN-521 avec de 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (SPD) contenant Ca2 + et Mg2 + pour un volume total de 300 µL / puits.
- Pipette de la solution de revêtement dans les puits, sceller la plaque bien avec du parafilm et incuber une nuit à 4 ° C. Plaques de revêtement peuvent être conservés à 4 ° C pendant 2 semaines.
(Facultatif) : par ailleurs, un protocole de couche rapide, incuber les boîtes bien avec solution de revêtement pendant 2 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Décongeler le flacon de LN-521 lentement à 4 ° C selon les instructions du fabricant.
- Préparer les hPSC milieu de culture (notamment essentiels 8 Flex) en complétant le milieu basal avec supplément fourni, comme indiqué par le fabricant. Ajouter 50 U/mL de pénicilline-streptomycine. Notez que la formulation est sensible à la lumière qu’à haute température. Décongeler le supplément et réchauffer les médias à température ambiante (RT), abri de la lumière. Utiliser le milieu supplémenté hPSC dans les deux semaines suivant la date de la supplémentation.
- Enduire plaques 24 puits avec humaine recombinante laminin-521 (LN-521). Pour le premier passage (FF) exempte d’engraissement, utilisez LN-521 à une concentration de 1,09 µg/cm2et à 0.55 µg/cm2 pour les passages suivants. Les concentrations de LN-521 suggérées servent comme point de départ pour la culture réussie de FF mais peuvent être abaissées.
- Transfert de la hPSC à la culture FF sur LN-521
- Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
- HPSCs passage du système de culture standard sur des calques de conducteur (p. ex. inactivé prépuce humain (hFF) ou fibroblastes embryonnaires de souris) ou d’autres systèmes de culture de FF à l’aide de la méthode standard. Par exemple, colonies hPSC cultivés sur des cellules nourricières hFF peuvent être disséqués en petits morceaux avec un scalpel et les pièces détachées puis avec une pointe d’aiguille. PSC humaines cultivées à l’aide de systèmes de culture FF peut être transférées à l’aide de cluster passage méthode avec ou sans traitement préalable enzymatique.
- Enlever la solution de revêtement de LN-521 des 24-puits et ajouter 1 mL de milieu de hPSC pré chauffé par puits.
Remarque : Ne pas laisser les puits à sec comme LN-521 inactive après séchage. - Transférer les grappes de morceaux/cellule de colonie à LN-521 enduit 24-puits dans le milieu de hPSC avec une pipette. Transférer des morceaux de colonie de 20 – 30 / puits, éviter la surpopulation des puits.
- Remplacer le support par 1 mL de milieu hPSC le jour après transfert et tous les deux jours par la suite. Les cultures sont prêts pour le passage 3 à 4 jours plus tard comme hPSCs sont devenus des colonies à la morphologie bien lisse et non différenciée. Pour référence, voir Figure 1 b (première image). Pour le premier passage de FF, les colonies ne puissent pas passer à une monocouche confluente entièrement, mais les cultures doivent être repiquées quand colonies atteignent une taille approximative de 1 mm.
- Passant et maintien de la culture hPSC FF
- Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
- Le deuxième passage de FF partir, passage le hPSCs FF lorsque la culture atteint confluence de 80 à 100 %. HPSCs FF passage à nouveau LN-521 enduit plaques 24 puits à l’aide de cellule unique passage deux fois par semaine (les lundis et jeudis) pour maintenir des cultures de haute qualité avec une morphologie indifférenciée et d’atteindre le régime alimentaire exempt de week-end. Pour plus de détails, veuillez vous référer à18,24,25.
- Rincer la hPSCs FF deux fois avec 1 mL de 1 x DPBS sans Ca2 + et Mg2 +.
- Détacher, FF hPSCs exempt de xeno trypsine-EDTA (spécifiquement TrypLE sélectionnez Enzyme) en incubation 500 µL / puits à 37 ° C, 5 % de CO2. Pour les temps d’incubation optimale, permettent les cellules pour arrondir vers le haut, mais ne pas à se détacher. Cela prend généralement 3 min à 37 ° C, 5 % de CO2 (ne pas dépasser les 5 min).
- Supprimer la trypsine-EDTA xeno-gratuit et immédiatement ajouter 500 µL / puits d’inhibiteur de la trypsine définis.
- Détacher FF hPSCs en pipettant également, prudent, mais approfondie afin d’obtenir une suspension monocellulaire. Transférer la suspension de hPSC FF à travers un tamis de cellule de 40 µm dans un tube à centrifuger coniques 15 mL contenant le support hPSC préchauffé.
- Laver les puits avec 1 mL de milieu hPSC et ajouter le support de lavage dans le tube à centrifuger conique 15 mL.
- Centrifuger la suspension monocellulaire pendant 5 min à 300 x g, aspirer le culot cellulaire et remettre en suspension dans 1 mL de milieu de hPSC préchauffé.
- Compter les cellules avec hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées.
- Enlever la solution de revêtement de LN-521 (0.55 µg/cm2) 24-puits et ajoutez hPSC moyen comme 1.2.3.
- HPSCs FF plaque sur 0,55 µg/cm2 LN-521 enduit 24-puits à une densité de 40 000 à 50 000 cellules/cm2.
- Remplacez moyen moyen hPSC fraîches au lendemain du passage et tous les deux jours par la suite, à l’exclusion des dimanches.
- Les cellules sont prêtes à être utilisées pour différencier 3-4 jours après le passage, lorsque la culture a atteint > confluence de 85 %. Pour assurer la qualité de l’hPSCs, reportez-vous aux méthodes de caractérisation décrits en détail dans précédents travaux18,24,25. Il est recommandé de seulement la culture hPSCs jusqu’au niveau de passage 15 dans le système de FF à l’aide de la cellule unique passage afin d’éviter des changements caryotypiques. Utilisez uniquement des hPSCs de haute qualité, indifférencié comme matériau pour les différenciations de départ.
2. différenciation et cryoconservation des dérivés hPSC LESCs
- Préparations
- Préparer le milieu d’induction xeno-free basal (milieu d’induction basale) : supplément Dulbecco aigle modifié (plus précisément KnockOut DMEM) avec 15 % de remplacement sérum exempt de xeno (spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM de L-glutamine, 0,1 mM 2 - mercaptoéthanol, 1 % des acides aminés non essentiels et 50 U/mL de pénicilline-streptomycine. Utiliser le milieu basal de l’induction dans les deux semaines.
- Préparer les médias pour l’induction de cornée en culture en suspension.
- Jour 1 : Compléter le milieu basal induction avec 5 μM blebbistatin.
- Jour 2 : Supplément milieu basal induction avec 10 µM SB-505124 et 50 ng/mL humaine fondamentale fibroblast growth factor (bFGF).
- Jour 3-4 : supplément milieu basal induction avec 25 protéine morphogénétique de l’OS ng/mL 4 (BMP-4).
- Préparer le moyen de différenciation de l’épithélium cornéen (moyen de différenciation, spécifiquement CnT-30) pour la culture adhérente : ajouter des suppléments au milieu de base selon les instructions du fabricant et 50 U/mL de pénicilline-streptomycine.
NOTE : Formulation moyenne de différenciation est sensible à la lumière. Utiliser le milieu supplémenté de différenciation dans les 6 semaines suivant la date de la supplémentation. - Enrober les plats de vitroplants de 100 mm pour différenciation adhérente (voir étape 2.3) avec un mélange de 5 µg/cm2 humain placentaire du collagène de type IV (col IV) et 0,5 µg/cm2 LN-521 dilué dans 1 x DPBS contenant Ca2 + et Mg2 +, dans un total volume de 5 mL par plat de revêtement. Préparer et stocker les revêtements avec col IV et LN-521 tel que décrit dans 1.1.1.3.
-
Étape i : induction cornée en culture en suspension
- Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
- Détacher le hPSCs FF à suspension monocellulaire xeno-free trypsine-EDTA comme indiqué dans les étapes 1.3.2.1–1.3.2.6. Compter les cellules non vides et distribuer les 2-3 x 106 cellules / faible fixation plaque 6 puits bien, dans un volume total de 3 mL de milieu d’induction basale additionné de 5 μM blebbistatin à induire la formation de EB nuit à 37 ° C, 5 % de CO2 (jour 1).
- Le lendemain (jour 2), enlever le support et remplacez avec 3 mL de milieu d’induction basale additionné de 10 µM bFGF de SB-505124 et 50 ng/mL.
- Ce qui suit deux jours (jours 3-4), enlever le support et remplacez avec 3 mL de milieu d’induction basale additionné de 25 ng/mL BMP-4.
- Etape II : Différenciation cornée en culture adhérente
- Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
- Le jour 5, plaque l’EBs vers le bas sur des plats de vitroplants 100 mm recouverts de 5 µg/cm2 col IV et 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Enlever la solution de revêtement de vaisselle de vitroplants de 100 mm et ajouter 10 mL de milieu de différenciation préchauffé par plat.
Remarque : Ne pas laisser la vaisselle sécher comme LN-521 inactive après séchage. - Transférer l’EBs d’une plaque de 6 puits bien de deux ou trois plats de vitroplants de 100 mm (environ 50 EBs par cm2) de pipetage. Répartir l’EBs en agitant doucement.
- Enlever la solution de revêtement de vaisselle de vitroplants de 100 mm et ajouter 10 mL de milieu de différenciation préchauffé par plat.
- Maintenir les cellules en culture adhérente à 37 ° C, 5 % CO2, remplaçant le milieu avec 10 mL de milieu de différenciation frais trois fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) pour les prochaines semaines de 2,5 à 3. Vérifier les cellules régulièrement pour l’émergence de la morphologie épithéliale correcte à l’aide du microscope à contraste de phase.
- Étape III : Cryo-bancaire hPSC dérivés LESCs
- Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire, sauf pour le support de cryoconservation qui devrait être préalablement refroidi.
- Détacher les dérivés hPSC LESCs avec la trypsine-EDTA xeno-free et compter les cellules, en suivant les instructions pour hPSCs FF 1.3.2.1–1.3.2.6 étapes mais en utilisant le moyen de différenciation.
Remarque : Pour LESCs dérivé de hPSC, le temps d’incubation optimale avec la trypsine-EDTA xeno-free est plus longue (environ 5 min). Utiliser 3 mL de xeno-free trypsine-EDTA et inhibiteur de la trypsine définis par plat de 100 mm. - Après avoir compté les cellules, répéter centrifugation pendant 5 min à 300 x g, aspirer moyen et Resuspendre le culot cellulaire dans un milieu de cryoconservation préalablement réfrigérées et xeno-libre hPSC. Pipette le single cell suspension en cryotubes afin que chaque cryotube contient 0,5 à 1 x 106 cellules dans 1 mL de milieu de cryoconservation.
- Placer les tubes dans un gel contenant et transfert immédiatement (à moins de 5 min) à-80 ° C durant la nuit.
- Le lendemain, transfert les tubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme.
- Étape IV : Décongeler les cryoconservés hPSC-LESCs
- Avant le dégel, enduire les plaques de plats/puits à 5 µg/cm2 col IV et de 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Réchauffez tous les matériaux nécessaires et les réactifs de RT dans la hotte à flux laminaire.
- Enlever la solution de revêtement des plats/puits et ajouter un volume approprié de moyen de différenciation préchauffé.
Remarque : Ne pas laisser la vaisselle sécher comme LN-521 inactive après séchage. - Décongeler les cellules rapidement à ta et transférer immédiatement la suspension de cellules dans un tube à centrifuger conique 15 mL contenant 5 mL de milieu de différenciation préchauffé.
- Centrifuger la suspension cellulaire pour 5 min à 300 x g, aspirer et Resuspendre le culot dans moyen de différenciation pour enlever n’importe quel support de cryoconservation.
- Plaque des cellules sur des plats/puits recouverts de 5 µg/cm2 col IV et 0,5 µg/cm2 LN-521, dans le milieu de la différenciation à une densité de 40 000 à 50 000 cellules/cm2. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5 % CO2, remplaçant le moyen de différenciation trois fois par semaine.
3. phénotypage des dérivés hPSC LESCs
- Analyse qualitative par immunofluorescence
- Pour l’immunofluorescence, manteau 24 ou 12 puits puits de plaque à 5 µg/cm2 col IV et 0,5 µg/cm2 LN-521 et plaque/dégel hPSC-LESCs dans le milieu de la différenciation à une densité de 40 000 à 50 000 cellules/cm2.
- Lorsque les cultures ont atteint confluence, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % (PFA) : laver les puits deux fois avec 1 x DPBS sans Ca2 + et Mg2 +et incuber pendant 15-20 min 4 % PFA à température ambiante. Par la suite, laver deux fois avec 1 x DPBS pour retirer tout résidu de la PFA. Utilisation de 0,5 à 1 mL de solutions / puits.
Remarque : Les cellules fixes peuvent être conservés dans 1 x DPBS à 4 ° C jusqu'à une semaine avant la coloration.
ATTENTION : PFA est toxique et corrosif. Gérez des PFA dans une hotte aspirante et porter des vêtements de protection, lunettes de protection et des gants. - Aspirer les 1 x DPBS et permeabilize des membranes cellulaires en incubant pendant 10-15 min avec 0,1 % de Triton X-100 dans 1 x DPBS.
- Aspirez 0,1 % Triton X-100 et bloc anticorps non-spécifiques accepteurs en incubant pendant 1 h avec 3 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans 1 x DPBS à des dilutions de l’anticorps primaire RT. Prepare à 0,5 % de BSA à 1 x DPBS.
NOTE : Voir le tableau 1 pour des anticorps primaires recommandées. - Aspirer 3 % de BSA et incuber avec anticorps primaires convenablement dilué pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver les puits 3 x pendant 5 min avec 1 x DPBS. Préparer des dilutions d’anticorps secondaire à 0,5 % de BSA à 1 x DPBS.
NOTE : Voir le tableau 1 pour les anticorps secondaires recommandées. - Aspirer 1 x DPBS et incuber avec anticorps secondaire convenable, convenablement dilué pendant 1 h à RT, abri de la lumière.
Remarque : Cette étape sur, conserver les échantillons à l’abri de la lumière afin d’éviter la décoloration des colorants fluorescents. - Laver les puits 3 x pour 5 min avec 1 x DPBS et enfin contre-colorant noyaux avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et le Mont avec support de montage de fluorescence. DAPI peut être utilisé séparément selon les instructions du fabricant ou inclus dans le milieu de montage. Place ronde lamelles couvre-objet (plaques diamètre 19 mm et 13 mm pour 12 et 24-puits, respectivement) dans chaque puits. Suivez les instructions du fabricant concernant le séchage et le stockage des échantillons montés.
- Images de cellules colorées avec un microscope à fluorescence.
- Analyse quantitative par immunofluorescence
- Préparer les échantillons cytospin de dérivés hPSC LESCs objet lunettes.
- Détacher les dérivés hPSC LESCs avec la trypsine-EDTA xeno-free et compter les cellules, en suivant les instructions à l’étape 2.4.2.
- Après avoir compté, ajouter des 1 x DPBS préalablement réfrigérées et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Réglez le volume de l’échantillon et la concentration cellulaire selon les instructions du fabricant de la cytocentrifuge donnée, par exemple 50 000 – 100 000 cellules dans un volume d’échantillon de 150 µL.
- Tourner les cellules vers le bas pour objet verres avec un cytocentrifuge par exemple 5 min à 28 x g et fix immédiatement pendant 15-20 min 4 % PFA dans 1 x DPBS à température ambiante. Pour le temps de rotation recommandée et de la vitesse, reportez-vous à la notice de la cytocentrifuge donnée.
- Procéder à la coloration des échantillons cytospin tel que décrit dans les étapes 3.1.3–3.1.8 utilisation liquide bloqueur plume entourent les échantillons avec un cercle hydrophobe et procéder à la coloration dans une gouttelette pour la pratique économique. Lavages peuvent être effectués dans des récipients avec les détenteurs de la diapositive, afin d’assurer une élimination efficace des anticorps excédentaires et la coloration de fond minimal. Contre-coloration noyaux au DAPI et monter les échantillons colorés avec fluorescence médias, couvrant avec lamelles de montage. Suivez les instructions du fabricant concernant le séchage et le stockage des échantillons montés.
- Capturer des images de 5 à 10 par exemple à des endroits choisis au hasard en utilisant par exemple 10 X grossissement d’un microscope à fluorescence.
- Estimer le pourcentage de cellules colorées positivement en ce qui concerne les cellules (DAPI positif) totales, par exemple avec des outils logiciels (https://imagej.nih.gov/ij/) analyse et de traitement d’images ImageJ. Préférence analyser > 500 cellules par exemple.
- Ouvrez l’image à analyser dans les logiciels ImageJ. Dupliquer l’image et le filtre Flou gaussien par défaut pour supprimer le bruit.
- Créer un seuil. Ajustez les valeurs de seuil pour une sélection optimale de noyaux de cellules colorées positivement et s’appliquent. L’image dupliquée est maintenant convertie à un affichage binaire.
- Processus de l’image binaire avec traitement binaire outils « Trous de remplissage » et « Bassin versant », qui séparera automatiquement fusionnés zones représentant les noyaux unique.
- Utilisez l’outil de « Particules Analyze » pour automatiquement liste régions d’intérêts (ROIs) de la fenêtre Gestionnaire de ROI, qui ouvrira ses portes dès la mise de la commande. Fermez l’image binaire.
- Visualiser la ROIs de l’image originale en choisissant « Afficher tout » dans le gestionnaire de ROI. Confirmer la sélection correcte de noyaux de cellules colorées et le cas échéant, supprimer manuellement et ajouter des sélections individuelles.
- Préparer les échantillons cytospin de dérivés hPSC LESCs objet lunettes.
- Analyse en cytométrie en flux
- Pour vérifier les niveaux d’expression p63α, tacher les cellules pour la cytométrie en flux.
- Détacher les dérivés hPSC LESCs avec la trypsine-EDTA xeno-free et compter les cellules, en suivant les instructions à l’étape 2.4.2.
- Laver les cellules deux fois avec 1 mL préalablement réfrigérée 1 x DPBS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Fix et permeabilize avec une solution prête à l’emploi fixation/perméabilisation pendant 20 min à 4 ° C. Par la suite laver les cellules deux fois avec 1 mL réfrigérés avant 1 x perméabiliser le tampon de lavage.
Remarque : Cette étape sur, garder les cellules à 4 ° C ou sur la glace, sauf indication contraire. - ATTENTION : Solution de Fixation/perméabilisation contient du formaldéhyde de 4,2 %. Gérez la solution dangereuse sous une hotte et porter des vêtements de protection, lunettes de protection et des gants.
- Diviser les échantillons dans des tubes en polypropylène de 5 mL. Chaque échantillon doit contenir 100 000 – 200 000 cellules et le volume de l’échantillon doit être ajusté à environ 100 µL de 1 x tampon de lavage.
- Ajouter 2 µL de fluorochrome conjugué p63-α FACS anticorps (anticorps recommandés, voir tableau des équipements et matériels) dans les tubes à échantillon. Laisser un échantillon non souillées enregistré pour servir de témoin négatif. Vortex les échantillons et incuber pendant 1 heure à ta, abri de la lumière.
- Laver les cellules deux fois avec 1 mL d’avance réfrigérées 1 x tampon de lavage et enfin, remettre en suspension les pellets avec 300 µL de tampon. Stocker les tubes sur la glace, abri de la lumière.
- Analyse des échantillons avec un cytomètre en flux. Utilisez l’exemple de contrôle négatif non colorés pour blocage de la population cellulaire correcte et d’exclure le signal de fond fluorescent. Analyser un minimum de 10 000 p63-α-coloration des cellules. Pour la mise en œuvre technique détaillé, veuillez vous référer au manuel d’utilisation du cytomètre en flux donné.
- Pour vérifier les niveaux d’expression p63α, tacher les cellules pour la cytométrie en flux.
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Representative Results
De hPSCs à hPSC-LESCs
L’ensemble du processus d’induire la différenciation de FF hPSCs à cryostoring hPSC-LESCs prend environ 3,5 semaines. Figure 1 aprésente un aperçu schématique de la méthode de différenciation mettant en évidence ses principales étapes. Figure 1 b montre une morphologie typique des populations de cellules dans les différentes phases du protocole. Les données présentées sont obtenues avec la ligne de CSEh Regea08/017 et UTA.04607.WT hiPSC ligne, dérivés tant caractérisé à l’Université de Tampere, en Finlande, comme décrit plus haut26,27,28.
Sur LN-521 dans un milieu hPSC, les hPSCs de FF indifférenciées, de haute qualité, tout d’abord forme colonies distinctes à arêtes vives, qui se fondent aux monocouches homogènes sur la confluence (Figure 1 b, première image). Plusieurs lignées de CSEh et hiPSC dérivées individuellement et génétiquement distinctes ont été avec succès adaptées et mis en culture avec ce système. Les populations de hPSC FF multiplient environ 3 fois dans chaque passage, fournissant un moyen robuste pour générer les xéno- et à partir de matériau pour des différenciations25sans chargeur. En général, l’induction de 24h dans un milieu EB produit une suspension d’EBs serrés, réguliers, de différentes tailles (Figure 1 b, deuxième image). Pendant l’induction surface ectodermique en suspension (jour 2 – 4), la morphologie EB ne devrait pas changer radicalement. Excroissance coloniale apparaît peu après l’EBs sont plaqués sur col IV/LN-521 combinaison matrice dans le milieu de la différenciation (Figure 1 b, troisième et quatrième images), et au sein de 21 à 25 jours de la différenciation, les cellules forment confluentes couches homogènes avec polygonale morphologie typique aux cellules épithéliales (Figure 1 b, cinquième image). Les cellules peuvent alors être cryostored pour une utilisation ultérieure. Viabilité et la morphologie sont bien conservés après décongélation les hPSC-LESCs (Figure 1 b, dernière image).
En général, 3 x 106 FF hPSCs plaqués pour une seule plaque 6 puits produisent suffisamment EBs à être plaqué de la culture adhérente à 2 – 3 récipients de culture cellulaire (100 mm). De chaque plat de 100 mm, 1 à 1,5 x 106 cellules peuvent être récoltées pour cryobanking par jour 22 – 25 de différenciation. En moyenne, chaque hPSC FF indifférenciée génère 0,7 cellules par jour 25 (Figure 2).
Validation des dérivés hPSC LESCs
En l’absence de protéines spécifiques de marqueurs LESC, le phénotype cellulaire correcte est confirmé par un ensemble de marqueurs qui montrent la diminution de l’expression de la pluripotence protéines associées et a augmenté l’expression de marqueurs LESC reconnus. Au jour 24 de différenciation, la grande majorité de la hPSC dérivés LESCs express appariés boîte protéine PAX6 (PAX6), le régulateur clé de développement de le œil, ainsi que p63α, le marqueur LESC largement reconnu. Le ΔNp63 tronqué p63-isoforme est exprimée conjointement dans la plupart des cellules p63α-positif, confirmant le phénotype de cellule ΔNp63α-positif plus spécifiques à la cornée. Basales marqueurs épithéliaux et putatif LESC marqueurs cytokératines (CK) -15 et CK-14 sont exprimées en partie, alors que le marqueur de cellules souches pluripotentes OCT3/4 et mature marqueur épithélial cornéenne CK-12 sont indétectables à ce stade. Ceci indique la différentiation de hPSCs FF vers les progéniteurs épithéliales limbique unipotent, mais pas encore de borne différentiation en cellules épithéliales cornéennes matures. (Figure 3 a) Les hPSC-LESCs conservent avec succès leur phénotype après récupération de cryoconservation (données comparables à la Figure 3 a).
Après 24 jours de différenciation, ΔNp63 a été exprimé à 66,2 % (n = 33, SD 9,3 %) de Regea08/017 CSEh-LESCs et 65,7 % (n = 10, SD 4,1 %) Uta.04607.WT hiPSC-LESCs (quantifiés de cytospin échantillons, Figure 3 b). Après récupération de cryoconservation, 82,2 % (n = 10, SD 5,7 %) des CSEh-LESCs et 90,5 % (n = 10, SD=3.7%) de hiPSC-LESCs exprimé ΔNp63 (quantifié de plats du jour 26 – 28, Figure 3 b).
L’expression p63α a été confirmée par analyse en cytométrie en flux pour Regea08/017 CSEh-LESCs. Jour 25 de différenciation, 62 % des hPSC-LESCs fraîchement différenciés étaient positifs pour p63α. Deux jours après la récupération de cryoconservation (jour 28 au total), 81 % des cellules étaient séropositifs au p63α (Figure 3).
Figure 1 : illustration schématique du protocole de différenciation hPSC-LESC (A) et morphologies cellulaires typiques observées dans les différentes phases du processus (B). EBs sont formés d’une suspension monocellulaire de haute qualité, hPSCs indifférencié au cours de l’induction de petite molécule première 24 h. trois jours vers l’ectoderme de surface en suspension est suivie par la phase de différenciation adhérentes. Jour 24 de différenciation, la majorité des cellules Voir la morphologie typique LESC. Images représentatives indiquées pour Regea08/017 CSEh ligne avant et durant la différenciation. Noir balance bar = 200 µm, valable pour toutes les images dans le panneau. Abréviations : Blebb. : blebbistatin, SB : SB-505124 petite molécule inhibiteur, bFGF : facteur de croissance basique des fibroblastes, BMP-4 : bone morphogenetic protein 4, LN-521 : laminine recombinante humaine 521, col IV : collagène placentaire humaine de type IV, hPSC : pluripotentes humaines cellules souches, EB : corps embryoïdes, LESC : les cellules souches épithéliales limbique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : rendement cellulaire attendue. Boîtes indiquant le nombre de cellules obtenues pour cryostoring le jour 22-25, de différenciation, divisée par le nombre de hPSCs indifférencié plaqué pour l’étape de formation EB au jour 0. Sur moyenne 0,72 (SD 0,4) cellules ont été produites de chaque pluripotentes Regea08/017 CSEh, tandis que de 0,78 (SD 0,67), les cellules ont été produites de chaque hiPSC UTA.04607.WT. n : nombre d’expériences de différenciation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Attendu le phénotype des dérivés hPSC LESCs. Anticorps immunofluorescence labeling expression uniforme (A) montrant des régulateur de développement d’oeil PAX6 et reconnu LESC marqueurs p63α et ses isoformes de ΔNp63, ainsi que deux autres ont suggéré des marqueurs LESC - CK15 et 14. Marqueur de pluripotence OCT3/4 et mature marqueur épithélial cornéenne CK-12 sont négatifs. Images représentatives des s’est montrés pour Regea08/017 CSEh-LESCs au jour 24 de différenciation. Barreaux de l’échelle = 100 µm. (B) ΔNp63 cellules de fraîchement différenciées et cryostored hPSC-LESCs montre que les cellules ne conservent pas seulement, mais montrent une augmentation ΔNp63 expression après cryoconservation. Compter les cellules résultats montrent > 65 % des hPSC-LESCs fraîchement différenciées teinté positif pour ΔNp63 avant l’intervention de cryobanking, et > 80 % après la réussite de la récupération. n = nombre d’expériences de différenciation distincts (minimum de 600 cellules comptées par échantillon et > 1600 cellules par point dans le temps) analyse en cytométrie en flux (C) montrant les 62 % des hPSC-LESCs fraîchement différenciées et 81 % des cellules décongelées positive pour p63α, confirmant la cellule comptage des résulats de la ligne Regea08/017. * B-C indiquer cellules décongelées. Histogramme de rouge pour l’échantillon positif et noir pour l’échantillon négatif de (non coloré). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Anticorps | Hôte | Dilution |
| Anticorps primaires car si | ||
| PAX6 | lapin | 1 : 200 |
| p63α | souris | 1 : 200 |
| ΔNp63α | lapin | 1 : 200 |
| CK-15 | souris | 1 : 200 |
| CK-14 | souris | 1 : 200 |
| CK-12 | chèvre | 1 : 200 |
| OCT3/4 | chèvre | 1 : 200 |
| Anticorps secondaires car si | ||
| Alexa Fluor 568 anti-chèvre Ig | âne | 1:800 |
| Alexa Fluor 568 anti-souris Ig | âne | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-lapin Ig | âne | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-souris Ig | âne | 1:800 |
Tableau 1 : recommandé des anticorps primaires et secondaires utilisés pour l’immunofluorescence (IF) étiquetage des dérivés hPSC LESCs. Voir Table des matières pour les fabricants.
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Discussion
Le résultat escompté de ce protocole est la génération réussie et robuste de LESCs d’une suspension monocellulaire de hPSC FF environ 3,5 semaines. Comme l’épithélium cornéen se développe à partir de l’ectoderme de surface29, la première étape du protocole vise à hPSCs vers cette lignée de direction. Une induction courte 24h avec transformation antagoniste du facteur de croissance bêta (TGF-β) SB-505124 et bFGF sont utilisés pour induire la différenciation ectodermique, suivie par mésodermiques cue de BMP-4 h 48 pour pousser les cellules vers l’ectoderme de surface. L’étape suivante de la différenciation adhérentes sur col IV/LN-521 combinaison matrix ainsi que de moyen de différenciation chimiquement défini sert à mieux orienter la différenciation vers LESCs.
Haute qualité des matières premières (le hPSCs de FF) est essentielle pour la différenciation réussie. Seulement FF hPSC cultures avec près de confluence et près de 100 % du phénotype indifférencié doivent être utilisés. HPSC régulier caryotypage est recommandé, comme passage de cellule unique peut prédisposer hPSCs à des anomalies caryotypiques concourant à la croissance et la différenciation avantages30. Une exposition prolongée à la trypsine peut causer inadéquate EB formation ou hPSC la mort. Le protocole a été testé avec cinq dérivés individuellement et génétiquement distinctes hPSC lignes, lignes les CSEh et hiPSC. Il n’y avait aucun besoin de cellule ligne des modifications spécifiques à la concentration de petites molécules ou temps d’induction. Cependant, au cours de l’optimisation initiale du protocole, mort cellulaire excessive ou l’apparence des cellules dont la morphologie fibroblastique, neuronale ou autre a indiqué différenciation aux lignées indésirables. Dans ce cas, la méthode peut nécessiter de réglage fin. Les formats de navire la culture constituent un point de départ et peuvent être rehaussées de tailles recommandées.
L’ensemble du protocole de hPSC culture de cryoconservation et différenciation LESC est défini, permettant une transition aisée pour les bonnes pratiques de fabrication (BPF) pour la production de cellule produits de thérapie. Comme les médias commerciaux et les réactifs subissent développement robuste, de fabrication et de contrôle de qualité, ils fournissent une plateforme de qualité cohérente et uniforme pour la différenciation et de la culture de hPSC. Les conditions définies minimiser la variation de lot, qui offre un avantage sur les hPSC-LESC différenciation protocoles10,11,12,13,14, 20 , 22 , 23. le protocole relativement simple et rapide offre également un avantage sur les trois dimensions organoïdes cornéenne qui sont difficiles à normaliser dans les lignées cellulaires et les laboratoires et nécessitent des méthodes robustes pour purifier les types de cellules désiré31 ,,32. En outre, le protocole très efficace permet robuste pour produire LESCs pour des fins de recherche, par exemple de maladie modélisation, génie génétique, dépistage des drogues et des tests toxicologiques. Par ailleurs, la plate-forme peut être facilement adaptée pour la différenciation des autres types de cellules épithéliales oculaires tels que les pigments rétiniens des cellules épithéliales (cellules RPE)25.
Thérapie de remplacement de cellules limbique réussie nécessite seulement quelques milliers p63-positif LESCs4, chaque œil, mais assurance qualité nécessite populations cellulaires supplémentaires et production donc à grande échelle. Cryobanking permet la préparation des stocks de cellules disponibles pour la transplantation, ainsi que pour la qualité et les tests de sécurité. En outre, la pureté de la hPSC-LESC améliore après cryostoring et en outre après passage et prolongée culture25, tel que suggéré par l’expression ΔNp63 accrue.
En résumé, cette méthode robuste génère des cellules positives à le ΔNp63α de hPSCs 3,5 semaines dans des conditions de culture acellulaire xeno - et chargeur. Les méthodes de culture cellulaire présentés ici permettent la production d’utilisation de la thérapie qualité LESCs cellule applicables aux oculaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été financée par l’Académie de Finlande (numéro de licence 297886), le programme des pièces de rechange humaine de Tekes, l’Agence finlandaise de financement pour la technologie et l’Innovation, le œil finlandais et Tissue Bank Foundation et la Fondation culturelle finlandaise. Les auteurs remercient les techniciens de laboratoire biomédical Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt et Outi Heikkilä excellente assistance technique et de la contribution à la culture cellulaire. Professeur Katriina Aalto-Setälä est reconnu pour prévoyant la fourniture d’équipements pour l’imagerie de fluorescence de la hiPSC ligne utilisée et BioMediTech Imaging Core facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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