Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto
Summary
Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.
Abstract
Tem sido um desafio para cientistas de expressar proteínas recombinantes de eucariotas secretoras para estudos bioquímicos e estruturais. O sistema de expressão de células de inseto mediada por baculovirus é um dos sistemas utilizados para expressar proteínas recombinantes de secretoras eucarióticas, com algumas modificações borne-translational. As proteínas secretoras precisam ser roteadas através de vias secretoras para proteína glycosylation, formação de ligações de bissulfeto e outras modificações borne-translational. Para melhorar a expressão célula inseto existentes de proteínas vegetais secretora, um vetor de expressão de baculovirus é modificado pela adição de qualquer um GP67 ou uma sequência de peptídeo sinal hemolin entre o promotor e a clonagem de vários sites. Este sistema de vetor modificado recentemente projetado com sucesso produzido um alto rendimento de proteínas do receptor solúvel recombinante secretada planta de Arabidopsis thaliana. Duas das proteínas expressas da planta, os domínios extracelulares de receptores de membrana plasmática de Arabidopsis TDR e PRK3, foram cristalizada para estudos cristalográficos de raio-x. O sistema do vetor modificado é uma ferramenta melhorada que potencialmente pode ser usada para a expressão de proteínas recombinantes de secretoras no reino animal também.
Introduction
É imperativo para um laboratório de pesquisa ser capaz de produzir grandes quantidades de proteínas recombinantes homogêneas para Caracterização bioquímica e biofísica, especialmente para estudos cristalográficos de raio-x. Existem muitos sistemas de expressão heteróloga bem estabelecidas, tais como Escherichia coli, levedura, células de inseto, células de mamíferos, células vegetais, etc. , entre eles, o sistema de expressão de células de inseto mediada por baculovirus é um dos mais comumente usado técnicas para produzir grandes quantidades de estruturalmente dobrado de grande porte eukaryotic proteínas recombinantes para cristalização de proteínas1.
Os vetores de expressão do sistema de expressão de baculovirus são projetados para conter uma forte polyhedrin ou promotor P10 para produzir um alto rendimento de proteínas recombinantes intracelular2,3. Para tornar um baculovirus recombinante, o gene de interesse foi clonado em um inseto vetor contendo o locus polyhedrin (polh) do genoma de multi-nucleopolyhedroviral Autographa californica . A construção resultante é então sequenciada e seu quadro correto de leitura aberta (ORF) é verificado. A construção correta é então introduzida célula hospedeira de insetos através do processo do transfection. O gene de interesse é inserido no genoma viral por recombinação homóloga. Este evento resulta na produção do genoma viral recombinante, que é então replicada para produzir recombinante brotou de partículas do vírus1.
As células de insetos que são mais comumente usadas no sistema de expressão são Sf9 e alta cinco células (Hi5). Sf9 células são uma clonal isolada de Sf21, derivado das células dos ovários pupal de Spodoptera frugiperda, e Hi5 células são uma clonal isolada derivada o parental Trichoplusia ni ovário célula linha TN-3684,5. Co transfections, amplificação de vírus e ensaios de placa são realizados em células de Sf9, enquanto células Hi5 são normalmente Selecionadodas para produzir maiores quantidades de proteínas recombinantes6. É interessante notar que as células do Hi5 não são adequadas para a geração e amplificação de progênies de vírus por causa de sua tendência a produzir vírus mutantes. Tradicionalmente, uma faixa de temperatura de 25-30 ° C é considerada bom para o cultivo de células de inseto. No entanto, foi relatado que o 27-28 ° C é a temperatura ideal para o inseto celular crescimento e infecção7,8.
A introdução de uma sequência de forte sinal precede o gene é necessária para a alta expressão das proteínas secretadas. A sequência de sinal guiariam eficientemente a proteína recombinante traduzida no retículo endoplasmático por secreção de proteína e modificações borne-translational necessárias para dobramento adequado e de estabilização3. Sequências de peptídeo sinal, tais como os baculovirus envelop proteína GP64/67, Melitina abelha e outros, foram escolhidas para facilitar a expressão de proteínas recombinantes secretoras no expressão mediada por baculovirus sistemas3. A introdução do peptídeo sinal de GP67 foi mostrada para melhorar o rendimento de expressão de uma proteína recombinante secretado, em comparação com usando o peptídeo sinal intrínseco do gene alvo9. Hemolin é uma proteína de hemolinfa da mariposa gigante de seda Hyalophora cecropia, induzida após infecção de bactérias10. Devido o nível relativamente elevado de expressão induzida, a sequência do peptídeo sinal do gene pode ser usada para mediar a expressão de secreção de proteínas recombinantes em sistema de célula de baculovirus-inseto.
O . thaliana Tracheary elemento de diferenciação Inhibitory Factor Receptor (TDR) e pólen Receptor quinase 3 (PRK3), ambos pertencem à família de repetição como Receptor quinase (LRR-RLK) planta rica em leucina de proteínas11,12 . Para estudar a estrutura e a função desta família de receptores proteínas vegetais, bem como para facilitar a caracterização estrutural e bioquímica de outras proteínas de planta secretada, foi modificado o sistema de expressão de células de baculovirus-inseto para Melhore o rendimento de produção e qualidade de proteína. Os domínios extracelulares de TDR e PRK3 com êxito foram expressas usando dois vetores de expressão modificados no sistema de expressão de célula de baculovirus-inseto. Cristalizaram-se ambos os domínios extracelulares de proteínas TDR e PRK3. Este artigo relata a expressão e purificação de grandes quantidades de proteínas recombinantes planta secretada com baculovirus modificados dois vetores da expressão, incorporando um GP67 ou uma sequência de sinal de hemolin entre o promotor e clonagem múltiplos sites.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dada a diversidade no tamanho e na estabilidade dos milhares de proteínas presentes nos sistemas biológicos, é frequentemente empírica para uma pesquisa laboratorial para decidir qual sistema de expressão heteróloga tem de ser escolhida para a expressão de uma proteína específica. O sistema de expressão de Escherichia coli é frequentemente a primeira escolha para a expressão da proteína devido ao curto ciclo de vida das bactérias, baixo custos dos meios de cultura e relativa facilidade para escalar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos fundos de inicialização nova faculdade da North Carolina State University para Guozhou Xu.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
Riferimenti
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