Summary

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Published: August 20, 2018
doi:

Summary

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Abstract

Rekombinant salgı ökaryotik proteinler yapısal ve biyokimyasal araştırmalar ifade etmek bilim adamları için bir mücadele vardı. Böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem rekombinant ökaryotik salgı proteinler bazı translasyonel modifikasyonlar ile ifade etmek için kullanılan sistemlerinden biridir. Salgı proteinler için protein glikozilasyon, disülfür bağları oluşumu ve diğer translasyonel modifikasyonlar salgı yollar aracılığıyla yönlendirilmesi gerekir. Varolan böcek hücre ifade salgı bitki proteinlerin artırmak için bir baculovirus ifade vektör ya bir GP67 eklenmesi ya da bir hemolin sinyal peptid sırası organizatörü ve çoklu klonlama siteleri arasında tarafından değiştirilir. Bu yeni tasarlanmış değiştirilmiş vektör sistemi başarıyla Arabidopsis thalianaçözünür rekombinant salgılanan bitki reseptör proteinler yüksek bir verim üretti. İki ifade bitki proteinleri, Arabidopsis TDR ve PRK3 plazma membran reseptörleri, ekstrasellüler etki x-ışını crystallographic çalışmalar için kristalize. Değiştirilmiş vektör sistemi salgı rekombinant proteinler de hayvan krallığının bir ifade için kullanılabilir gelişmiş bir araçtır.

Introduction

X-ışını crystallographic çalışmalar için özellikle Biyokimya ve biyofizik karakterizasyonu için homojen rekombinant proteinlerin büyük miktarlarda üretme yeteneğine sahip olması bir araştırma laboratuvarı için zorunludur. Escherichia coli, mantar, böcek hücreleri, memeli hücreleri, bitki hücreleri, vb aralarında gibi birçok tanınmış Contegra ifade sistemleri vardır, böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem en çoğunlukla teknikleri yapısal olarak katlanmış büyük ölçekli rekombinant ökaryotik proteinler protein kristalizasyon1için büyük miktarlarda üretmek için kullanılır.

İfade vektörel çizimler baculovirus ifade sisteminin güçlü polyhedrin veya yüksek bir verim rekombinant proteinler hücre içi2,3üretmek için P10 organizatörü içerecek şekilde tasarlanmıştır. Rekombinant baculovirus yapmak için faiz gen Autographa californica multi-nucleopolyhedroviral genom polyhedrin (polh) odağı içeren bir böcek vektörü klonlanmış. Elde edilen yapı sonra sıralı ve onun doğru açık okuma çerçevesi (ORF) doğrulanır. Doğru yapı sonra transfection sürecinde ana bilgisayar böcek hücresine tanıttı. Gen ilgi viral Genom tarafından Homolog rekombinasyon eklenir. Bu olay rekombinant üretmek için hangi sonra çoğaltır virüs parçacıkları1budded rekombinant viral genom üretiminde sonuçlanır.

İfade sisteminde en sık kullanılan böcek hücreleri Sf9 ve yüksek beş (Hi5) hücrelerdir. Spodoptera frugiperda, pupa yumurtalık hücrelerinden elde edilen Sf21, klonal bir izole Sf9 hücrelerdir ve ebeveyn Trichoplusia ni yumurtalık hücre satırı TN-3684,5dan türetilmiş bir klonal izole Hi5 hücrelerdir. Hi5 hücreleri genellikle rekombinant proteinler6daha yüksek miktarlarda üretmek için seçili iken eş transfections, virüs amplifikasyon ve plak deneyleri Sf9 hücreleri üzerinde yapılmaktadır. Hi5 hücreleri mutasyona uğramış virüs üretmek için onların eğilimi nedeniyle üretimi ve virüs ettiklerinizden amplifikasyon için uygun değildir fazlalaştı. Geleneksel olarak, 25-30 ° C sıcaklık aralığı böcek hücreleri ekimi için iyi olarak kabul edilir. Ancak, 27-28 ° C en uygun sıcaklık böcek hücre büyüme ve enfeksiyon7,için8olduğu bildirilmiştir.

Giriş Gen önceki bir güçlü sinyal sırasında salgılanan proteinler yüksek ifade için gereklidir. Sinyal sıra verimli bir şekilde çevrilmiş Rekombinant protein endoplazmik retikulum protein salgılanması ve translasyonel modifikasyonlar uygun katlama ve sabitleme3için gerekli için deliklere. Protein GP64/67, bal arısı melittin ve diğerleri, baculovirus örtmek gibi sinyal peptid dizileri, baculovirus-aracılı ifade sistemleri3salgı rekombinant proteinlerin ifadesi kolaylaştırmak için seçildi. GP67 sinyal peptid getirilmesi ile karşılaştırıldığında içsel sinyal peptid hedef gen9kullanarak salgılanan bir Rekombinant protein, ifade verimini artırmak için gösterilmiştir. Hemolin bir bakteri enfeksiyonu10indüklenen dev ipek güve Hyalophora cecropia, hemolymph proteindir. İndüklenen ifade nispeten yüksek seviyede nedeniyle, gen sinyal peptid dizisi rekombinant proteinlerin salgılanmasını ifade baculovirus-böcek hücre sisteminde arabuluculuk için kullanılabilir.

A. thaliana Tracheary öğesi farklılaşma inhibitör faktör reseptör (TDR) ve polen reseptör kinaz her ikisi de proteinler11,12 bitki lösin yönünden zengin tekrar reseptör benzeri kinaz (LRR-RLK) ailesine ait 3 (PRK3) . Yapısı ve fonksiyonu, bu ailenin diğer bitki salgılanan proteinler yapısal ve biyokimyasal karakterizasyonu kolaylaştırmak için bitki reseptör protein, de eğitim için baculovirus-böcek hücre ifade sistem için değiştirildi protein verim kalitesi ve üretim geliştirmek. Ekstrasellüler etki alanları TDR ve PRK3 başarıyla baculovirus-böcek hücre ifade sisteminde iki değiştirilmiş ifade vektörel çizimler kullanarak ifade edilmiştir. Her iki ekstrasellüler etki alanı TDR ve PRK3 proteinlerin kristalize. Ya bir GP67 ya da hemolin sinyal dizisi düzenleyici ve birden çok klonlama arasında dahil ederek ifade ve arıtma rekombinant salgılanan bitki proteinleri iki değiştirilmiş baculovirus ifade vektörel çizimler ile büyük miktarda Bu makale raporları siteleri.

Protocol

Not: Bir böcek cep/baculovirus sistemi ile değiştirilmiş ifade vektörel çizimler salgı bitki protein ifade ve kristalizasyon için kullanılır. 1. bir Baculovirus ifade vektör GP67 sinyal peptid bitki Protein salgılanması ifade ile modifikasyonu Bir 5′ BglII kesme makinası13, GP67 salgılanması sinyal sıra ve NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI ve XhoI (Şekil 1A) ile bir çok klonlama site içeren bir D…

Representative Results

Şekil 1′ de gösterildiği gibi iki değiştirilmiş pFastBac1 baculovirus ifade vektörel çizimler salgılanan proteinler ile GP67 ya da hemolin sinyal sıra hedef gen içsel sinyal sırasını değiştirmek için ifade etmek için kullanılmıştır. Viral GP67 ve böcek hemolin genler hücrelerde yüksek salgı ifade düzeyleri olmasını gösterdi. Füzyon protein ile ikisinden biri bu iki sinyal sıralarının salgı ifade düzeyleri büyük ölçüde …

Discussion

Çeşitlilik içinde büyüklük ve istikrar proteinlerin biyolojik sistemlerde mevcut binlerce göz önüne alındığında, bu kez bir araştırma için ampirik laboratuvar hangi Contegra ifade sistem karar vardır belirli bir protein ifade için seçilecek. E. coli ifade sistem kez up19ölçeklemek için ilk kısa yaşam döngüsü nedeniyle protein ifade bakterilerin düşük maliyetli Kültür Medya ve göreceli kolaylığı için seçimdir. Ancak, E. coli kullanarak 60 kDa …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Guozhou Xu için Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi yeni öğretim başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir.

Materials

Incubator shaker VWR Model Excella E25 27 oC
Incubator VWR Model 2005 27 oC
Centrifuge BECKMAN Model J-6 with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent 600677-51 For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler BIO-RAD Model C1000 Touch For PCR amplification of DNA
Incubator shaker New Brunswick Scientific Model I 24 For growing baceria culture
Customer DNA synthesis GENSCRIPT
BamHI (HF) New England Biolabs R3136S Restriction Endonuclease
BglII New England Biolabs R0144S Restriction Endonuclease
NotI (HF) New England Biolabs R3189S Restriction Endonuclease
XhoI New England Biolabs R0146S Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202T DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose Thermo Fisher Scientific 15510-019 For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell Invitrogen 18-258-012 For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth Research Product International Corp. L24066-5000.0 For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt Thermo Fisher Scientific 11593-019 Antibiotics
Kanamycin Sulfate Thermo Fisher Scientific 15160-054 Antibiotics
Tetracycline Thermo Fisher Scientific 64-75-5 Antibiotics
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710-064 Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells Thermo Fisher Scientific 10361-012 For making bacmid DNA
S.O.C. Medium Thermo Fisher Scientific 15544-034 For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362-101 Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System Thermo Fisher Scientific 10359-016 Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal Thermo Fisher Scientific 15519-028 For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG Thermo Fisher Scientific 15529-019 For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1 Thermo Fisher Scientific 10360014 Baculorirus expression vector
Sf9 cells Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 monolayer cells
Hi5 cells Thermo Fisher Scientific B85502 High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented Thermo Fisher Scientific 11595030 Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented Thermo Fisher Scientific 11605102 Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM Thermo Fisher Scientific 10902104 Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM Thermo Fisher Scientific 10486025 Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122 100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)  Thermo Fisher Scientific 25030081 100 ml
FBS Certified Thermo Fisher Scientific 16000-044 500 ml
6-well plates Thermo Fisher Scientific 08-772-1B Flat-bottom
150 mm plates Thermo Fisher Scientific 353025 100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1415-2500 500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1475-0511 25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1500-1211 25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430 NiNTA resin
pH-indicator strips EMD Millipore Corporation 1.09535.0001 pH 0 – 14

Riferimenti

  1. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
  2. Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
  3. Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
  4. Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
  5. Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
  6. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
  7. Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
  8. Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
  9. Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
  10. Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
  11. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
  12. Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
  13. Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
  14. Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
  15. Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
  16. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  18. Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
  19. Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
  20. Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
  21. Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
  22. Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
  23. Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
  24. Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
  25. Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
  26. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
  27. Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
  28. Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
  29. Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).

Play Video

Citazione di questo articolo
Chakraborty, S., Trihemasava, K., Xu, G. Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells. J. Vis. Exp. (138), e58283, doi:10.3791/58283 (2018).

View Video