إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر
Summary
نقدم هنا دليلاً عمليا لبناء نظام متكامل الفحص المجهري، والذي يدمج التقليدية برنامج التحصين الموسع-فلوري التصوير، وتصوير فائقة جزيء واحد القرار القائم على الكشف، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار جزيء واحد التصوير، إلى إنشاء واحدة بطريقة فعالة من حيث تكلفة.
Abstract
مجهر الأسفار أداة قوية للكشف عن الجزيئات البيولوجية في الموقع ورصد ديناميات والتفاعل في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار، تطورت تقنيات التصوير المختلفة لتحقيق أهداف تجريبية محددة. بعض التقنيات المستخدمة على نطاق واسع وتشمل الأسفار جزيء واحد الرنين نقل الطاقة (سمفريت)، التي يمكن أن تبلغ conformational التغييرات والتفاعلات الجزيئية مع القرار انغستروم، والقائم على الكشف عن جزيء واحد فائقة القرار (SR) التصوير، والذي يمكن أن يعزز هذا القرار المكانية حوالي عشرة إلى توينتيفولد مقارنة بالفحص المجهري حيود محدودة. وهنا يقدم نظام متكامل تصميم العميل الذي يقوم بدمج عدة أساليب التصوير في المجهر واحد، بما في ذلك تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية، تصوير ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك التصوير سمفريت. ويمكن تحقيق أساليب التصوير المختلفة بسهولة وتكاثر بتبديل العناصر البصرية. هذا التشكيل من السهل أن تعتمد أي مختبر البحوث في العلوم البيولوجية مع حاجة إلى روتين وتجارب التصوير المتنوعة في خفض التكلفة والمساحة بالنسبة إلى بناء المجاهر منفصلة لأغراض فردية.
Introduction
مجاهر الأسفار أدوات هامة لبحوث العلوم البيولوجية الحديثة والتصوير الفلورسنت تتم بشكل روتيني في الكثير من مختبرات البيولوجيا. بوضع علامات الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام مع فلوروفوريس، ونحن مباشرة تصور لهم تحت المجهر وتسجيل التغييرات التي تعتمد على الوقت في الترجمة، والمطابقة، والتفاعل، والجمعية الدولة فيفو في أو في المختبر. مجاهر الفلورية التقليدية لدينا قرار حيود محدودة المكاني، الذي هو ~ 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي، وشمال البحر الأبيض المتوسط ~ 500-700 في الاتجاه المحوري1،2، وهي، لذلك، تقتصر على التصوير في 100s من مقياس نانومتر إلى ميكرون. وقد وضعت بغية الكشف عن التفاصيل الدقيقة في الجمعية الجزيئية أو المنظمة، ميكروسكوبيس ريال المختلفة التي يمكن كسر الحد حيود. وتشمل الاستراتيجيات المستخدمة لتحقيق ريال التأثيرات البصرية غير الخطية، مثل الانبعاثات حفز استنفاد (STED) الفحص المجهري3،4 والمنظم الإضاءة مجهرية (SIM)5،6، 7، كشف العشوائية لجزيئات مفردة، مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)8 وفوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل)9، ومزيج من الاثنين، مثل مينفلوكس10. بين هذه ميكروسكوبيس ريال، يمكن تعديل مجاهر ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد بسهولة نسبيا من هيكل مجهر جزيء واحد. مع التنشيط المتكررة وتصوير فوتواكتيفاتابل البروتينات الفلورية (FPs) أو صور التحويل الأصباغ معلم على الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام، القرار المكانية يمكن أن تصل إلى 10-20 نانومتر11. للحصول على معلومات بشأن التفاعلات الجزيئية و conformational مطلوب الديناميات في القرار في الوقت الحقيقي، انغستروم إلى نانومتر. سمفريت،من1213 نهج واحد لتحقيق هذا القرار. عموما، واعتماداً على الأسئلة البيولوجية للفائدة، يلزم أساليب التصوير مع القرارات المكانية المختلفة.
عادة، لكل نوع من التصوير، يلزم تكوين محدد الإثارة و/أو الانبعاثات الضوئية. على سبيل المثال، أحد أساليب الإضاءة الأكثر استخداماً للكشف عن جزيء واحد من خلال الانعكاس الداخلية مجموع (النقل البري)، التي تحتاج إلى تحقيقه من خلال موشور أو من خلال عدسة الهدف بزاوية معينة من إثارة. للكشف عن سمفريت، الانبعاثات من الأصباغ كل من المانحين ويقبلون بحاجة إلى فصل مكانياً والموجهة إلى أجزاء مختلفة من الإلكترون ضرب، جهاز (امككد)، الذي يمكن أن يتحقق مع مجموعة من المرايا وشق شعاع مزدوج اللون وضعت في طريق الانبعاث. ثلاثي الأبعاد (3-D) ريال التصوير، عنصرا بصرية، مثل عدسة أسطوانية14، تحتاج ليسبب تأثير الاستجماتيزم في مسار الانبعاثات. ولذلك، [هومبويلت] أو مجاهر المتكاملة المتاحة تجارياً، عادة، وظيفيا المتخصصة لكل نوع من التصوير أسلوب وليست مرنة للتبديل بين مختلف أساليب التصوير في إنشاء نفس. نقدم هنا هو نظام هجين فعالة من حيث التكلفة، يوفر قابل للتعديل واستنساخه للتبديل بين ثلاث طرق مختلفة التصوير: تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية مع القرار حيود محدودة، ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد التصوير، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك سمفريت التصوير (الشكل 1A). على وجه التحديد، يتضمن الإعداد المقدمة هنا إلى جانب ألياف الليزر الإدخال للإثارة متعدد الألوان وذراع إضاءة تجارية في مسار الإثارة، الذي يسمح المبرمجة تحكم زاوية الإثارة، للتبديل بين وضع النقل البري الدولي وفي وضع برنامج التحصين الموسع. في مسار الانبعاثات، كاسيت عدسة أسطوانية قابلة للإزالة [هومبويلت] يوضع داخل الجسم المجهر للتصوير ثلاثي الأبعاد بريال، ويوضع مقسم شعاع تجارية قبل كاميرا امككد التي يمكن تمكين بشكل انتقائي للكشف عن قنوات متعددة في الانبعاثات في نفس الوقت.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظام المجهر الهجين هذا يلغي الحاجة إلى شراء مجاهر متعددة. التكلفة الإجمالية لجميع أجزاء، بما في ذلك الجدول البصرية، والبرمجيات والجدول التثبيت العمالة ومحطة العمل، هو حوالي 230,000 دولار. أجزاء آلة مخصصة، بما في ذلك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد، ويتكلف حوالي مبلغ 700 (التكلفة تعتمد على ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتسلم J.F. الدعم من برنامج العلماء سيرل وجائزة ابتكار جديدة لمدير المعاهد الوطنية للصحة. الكتاب تقر اقتراحات مفيدة من مختبر بول Selvin (جامعة إلينوي، اوربانا-شامبين) لتحديد المواقع العدسة ثلاثية الأبعاد.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Riferimenti
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
