Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.
Abstract
Fluoreszenz-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug biologische Moleküle in Situ zu erkennen und ihre Dynamik und Interaktionen in Echtzeit zu überwachen. Neben konventionellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie wurden verschiedene bildgebende Verfahren entwickelt, um spezifische experimentelle Ziele zu erreichen. Einige der weit verbreiteten Techniken umfassen Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (SmFRET), die Konformationsänderungen und molekulare Interaktionen mit Ångström Auflösung und Einzelmolekül-Erkennung-basierten berichten können Super-Resolution (SR) bildgebende Verfahren, die die räumliche Auflösung etwa zehn zu Lampentyp im Vergleich zur Beugung begrenzte Mikroskopie erhöhen kann. Hier präsentieren wir Ihnen ein Kunde entwickelt integriertes System, das mehrere bildgebende Verfahren in einem Gerät, einschließlich der konventionellen Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich SmFRET Bildgebung. Verschiedene bildgebende Verfahren können durch optische Schaltelemente leicht und reproduzierbar erreicht werden. Dieses Set-up ist einfach, von jedem Forschungslabor in den biologischen Wissenschaften mit einem Bedürfnis nach Routine und diverse bildgebenden Experimenten zu einem reduzierten Preis und Platz im Vergleich zu separaten Mikroskope für individuelle Zwecke bauen erlassen.
Introduction
Fluoreszenz Mikroskope sind wichtige Werkzeuge für die moderne biologische Forschung und Fluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Biologie Labors routinemäßig durchgeführt. Durch tagging Biomoleküle mit Fluorophore, können wir direkt unter dem Mikroskop zu visualisieren und erfassen die zeitabhängige Änderungen in Lokalisierung, Konformation, Interaktion, und Montage Zustand in Vivo oder in Vitro. Herkömmlichen Fluoreszenz Mikroskope haben eine Beugung begrenzte Ortsauflösung, die ~ 200-300 nm in seitlicher Richtung und ca. 500-700 nm in axialer Richtung1,2, und sind daher beschränkt auf Bildgebung bei der 100 s von Nanometer-µm-Skala. Um Feinheiten in der molekularen Montage oder Organisation zu offenbaren, entstanden verschiedene SR-Microscopies, die die Beugungsgrenze brechen kann. Strategien zur Erreichung SR umfassen eine nichtlineare optische Effekte, wie z. B. stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie3,4 und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)5,6, 7, stochastische Erkennung von einzelnen Molekülen, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)8 und photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM)9und eine Kombination aus beidem, z. B. MINFLUX10. Unter diesen Microscopies SR können Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskope relativ leicht von einem Einzelmolekül-Mikroskop-Set-up geändert werden. Mit sich wiederholenden Aktivierung und Bildgebung von Photoactivatable fluoreszierenden Proteinen (FPs) oder Foto-schaltbare Farbstoffen markiert auf Biomoleküle von Interesse kann räumlicher Auflösung 10-20 nm11erreichen. Informationen über molekulare Interaktionen und Konformationsänderungen gewinnen ist Dynamik in Echtzeit, Ångström-Nanometer Auflösung erforderlich. SmFRET12,13 ist ein Ansatz, um diese Auflösung zu erreichen. In der Regel abhängig von der biologischen Fragen von Interesse, werden bildgebende Verfahren mit unterschiedlicher räumlicher Auflösung benötigt.
In der Regel ist für jede Art der Bildgebung, bestimmte Erregung und/oder Emission optische Konfiguration erforderlich. Zum Beispiel ist eines der am häufigsten verwendete Beleuchtung-Methoden für die Einzelmolekül-Erkennung durch Totalreflexion (TIR), in denen ein bestimmte Erregung Winkel durch ein Prisma oder durch das Objektiv erreicht werden muss. Für die Erkennung von SmFRET müssen Emissionen von Donor und Akzeptor Farbstoffe räumlich getrennt und gerichtet auf verschiedene Teile der Elektron-Multiplikation, – Coupled Ladegerät (EMCCD), die mit einer Reihe von Spiegeln und dichroitischen Strahlteilern erreicht werden kann in der Emission Weg gelegt. Für dreidimensionale (3D) ist SR imaging, eine optische Komponente, wie z. B. eine Zylinderlinse14, musste einen Astigmatismus-Effekt in der Emission Pfad führen. Daher Homebuilt oder kommerziell erhältliche integrierte Mikroskope sind in der Regel, funktionell für jede Art von bildgebendes Verfahren spezialisiert und sind nicht flexibel wechseln zwischen verschiedenen bildgebenden Verfahren auf die gleiche Set-up. Hier präsentieren wir Ihnen ein kostengünstige, Hybridsystem, das verstellbare und reproduzierbare wechselt zwischen drei verschiedenen bildgebenden Verfahren bietet: konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung mit Beugung begrenzte Auflösung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung, einschließlich SmFRET imaging (Abbildung 1A). Insbesondere das Setup hier vorgestellten enthält fasergekoppelte Eingabe Laser für mehrfarbige Erregung und ein kommerzielle Beleuchtung Arm in die Erregung Weg, wodurch programmiert Kontrolle der Erregung Winkel zwischen Epi-Modus und TIR-Modus wechseln. In der Emission Weg eine abnehmbare Homebuilt Zylinderlinse Kassette befindet sich innerhalb des Körpers Mikroskop für SR 3D-Imaging und ein kommerziellen Strahlteiler befindet sich vor einer EMCCD Kamera, die selektiv aktiviert werden kann, um mehrere Kanäle der Emission zu erkennen gleichzeitig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Mikroskop Hybridsystem entfällt die Notwendigkeit, mehrere Mikroskope zu kaufen. Die Gesamtkosten für alle Teile, einschließlich der optischen Tisch, Tisch Einbau Arbeit, Software und Workstation, ist ungefähr $230.000. Benutzerdefinierte bearbeitet Teile, einschließlich der Mag Objektiv und 3-d-Objektiv kostet ca. $700 (der Preis hängt von der tatsächlichen Gebühren an verschiedenen Instituten). Typische kommerziell verfügbare integrierte Systeme für Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskopie mehr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.f. räumt Unterstützung von Searle Scholars Program und der NIH Direktor neue Innovator Award. Die Autoren erkennen nützliche Anregungen aus Paul Selvins Labor (University of Illinois, Urbana-Champaign) für die Positionierung der 3-d-Objektiv.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Riferimenti
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