Gennemføre flere Imaging tilstande med et fluorescens mikroskop
Summary
Her præsenterer vi en praktisk vejledning i opbygning af en integreret mikroskopi system, som fletter konventionelle epi-fluorescerende imaging, enkelt-molekyle påvisning funderet super-resolution imaging og multi-farve enkelt-molekyle afsløring, herunder enkelt-molekyle fluorescens resonans energioverførsel imaging, i én set-up på en omkostningseffektiv måde.
Abstract
Fluorescens mikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at opdage biologiske molekyler i situ og overvåge deres dynamik og samspil i realtid. Ud over konventionelle epi-Fluorescens mikroskopi, er forskellige Billeddannende teknikker blevet udviklet for at opnå specifikke eksperimentelle mål. Nogle af de anvendte teknikker omfatter enkelt-molekyle fluorescens resonans energi transfer (smFRET), som kan berette konformationel ændringer og molekylære interaktioner med ångstrøm opløsning og enkelt-molekyle opdagelse-baseret super-opløsning (SR) imaging, der kan styrke den rumlige opløsning ca ti at twentyfold i forhold til diffraktion-begrænset mikroskopi. Her præsenterer vi en kunde-designet integrerede system, som fusionerer flere Billeddannende metoder i et mikroskop, herunder konventionelle epi-fluorescerende imaging, enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR imaging og multi-farve enkelt-molekyle påvisning, herunder smFRET billeddannelse. Forskellige Billeddannende metoder kan nås nemt og reproducerbar ved at skifte optiske elementer. Dette set-up er nem at vedtage ved enhver research laboratory i biologiske videnskaber med behov for rutine og forskelligartede imaging eksperimenter på et reduceret omkostningerne og rum i forhold til bygge separate mikroskoper til individuelle formål.
Introduction
Fluorescens mikroskoper er vigtige værktøjer for den moderne biologiske forskning og fluorescerende imaging udføres rutinemæssigt i mange laboratorier, biologi. Ved tagging biomolekyler interesse med fluorophores, kan vi direkte visualisere dem under mikroskop og optage tidsafhængig ændringer i lokalisering, kropsbygning, interaktion, og forsamlingen stat in vivo eller in vitro. Konventionelle fluorescens mikroskoper har en diffraktion-begrænset rumlige opløsning, som er ~ 200-300 nm i lateral retning og ~ 500-700 nm i aksial retning1,2, og er derfor begrænset til billedbehandling på 100s af nanometer til micron skala. For at afsløre finere detaljer i den molekylære forsamling eller organisation, der er udviklet forskellige SR microscopies, der kan bryde diffraktion grænse. Strategier, der anvendes til at opnå SR omfatter ulineære optiske effekter, såsom stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi3,4 og struktureret belysning mikroskopi (SIM)5,6, 7, stokastiske påvisning af enkelt molekyler, som stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)8 og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)9, og en kombination af begge, som MINFLUX10. Blandt disse SR microscopies, enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR mikroskoper relativt nemt kan redigeres fra en enkelt-molekyle mikroskop set-up. Med gentagne aktivisering og billeddannelse af photoactivatable fluorescerende proteiner (FPs) eller foto-omstillelig farvestoffer markeret på biomolekyler af interesse, kan rumlige opløsning nå 10-20 nm11. For at få oplysninger om molekylære interaktioner og konformationelle er dynamics i realtid, Ångstrøm til nanometer opløsning påkrævet. smFRET12,13 er en metode til at opnå denne beslutning. Normalt, afhængigt af de biologiske spørgsmål af interesse, Billeddannende metoder med forskellige rumlige beslutninger er nødvendigt.
Typisk, for hver type af imaging, specifikke excitation og/eller emission optiske konfiguration er nødvendig. For eksempel, er en af de mest almindeligt anvendte belysning metoder til registrering af enkelt-molekyle gennem samlede interne reflection (TIR), hvor en specifik excitation vinkel skal opnås enten gennem et prisme eller objektive linse. Til smFRET påvisning skal emissioner fra både donor og acceptor farvestoffer være rumligt adskilt og rettet til forskellige dele af elektron-multiplikation, charge – sammen enhed (EMCCD), som kan opnås med et sæt spejle og dichroic beam splittere placeret i stien emission. For tre-dimensionelle (3-D) SR imaging, en optisk komponent, såsom en cylindrisk linse14, er nødvendig for at forårsage en bygningsfejl effekt i stien emission. Derfor, hjemmebygget eller kommercielt tilgængelige integreret mikroskoper er, normalt, funktionelt specialiserede for hver type af imaging metode og er ikke fleksible til at skifte mellem forskellige Billeddannende metoder på det samme set-up. Her præsenterer vi en omkostningseffektiv, hybridsystem, der giver justerbar og reproducerbare skifter mellem tre forskellige Billeddannende metoder: konventionelle epi-fluorescerende imaging med diffraktion-begrænset opløsning, enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR billedbehandling, og multi-farve enkelt-molekyle detektion, herunder smFRET imaging (figur 1A). Specifikt, set-up præsenteres her indeholder fiber-koblede input lasere til multi-farve excitation og en kommerciel belysning arm i stien excitation, som tillader programmeret kontrol af excitation vinkel, at skifte mellem epi-mode og TIR-tilstanden. I stien emission en flytbar hjemmebygget cylindrisk linse kassette er placeret i mikroskop kroppen for 3D-SR imaging og en kommerciel stråledeler er placeret før en EMCCD kamera, der kan aktiveres selektivt at opdage flere emission kanaler samtidigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne hybrid mikroskop system eliminerer behovet for at købe flere mikroskoper. De samlede omkostninger for alle dele, herunder optiske bordet, tabel installation arbejdskraft, software og arbejdsstation, er omkring $230,000. Custom-fræsede dele, herunder mag linse og 3D-objektiv, koste omkring $700 (omkostningerne afhænger af de faktiske afgifter på forskellige institutter). Typiske kommercielt tilgængelige integrerede systemer for enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR mikroskopi koste mere end $300.000 ~ 400.000 og…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. anerkender støtte fra programmet Searle forskere og NIH Directors nye Innovator Award. Forfatterne anerkender nyttige forslag fra Paul Selvin lab (University of Illinois, Urbana-Champaign) for positionering 3D-linsen.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Riferimenti
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
