Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza
Summary
Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.
Abstract
Microscopia di fluorescenza è un potente strumento per rilevare molecole biologiche in situ e monitorare le dinamiche e le interazioni in tempo reale. Oltre alla microscopia convenzionale epi-fluorescenza, varie tecniche di formazione immagine sono stati sviluppati per raggiungere specifici obiettivi sperimentali. Alcune delle tecniche ampiamente utilizzate includono il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola (smFRET), che può segnalare cambiamenti conformazionali e interazioni molecolari con angstrom risoluzione e singola molecola basata sul rilevamento Super-risoluzione (SR) di imaging, che può migliorare la risoluzione spaziale di circa dieci a twentyfold rispetto alla microscopia a diffrazione limitata. Qui presentiamo un sistema integrato di cliente-progettato, che fonde più metodi di imaging in un microscopio, compreso formazione immagine convenzionale di epi-fluorescente, singola molecola basata su rilevazione SR imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, compreso formazione immagine smFRET. Diversi metodi di imaging possono essere ottenute facilmente e riproducibile elementi ottici di commutazione. Questo set-up è facile da adottare presso un laboratorio di ricerca in scienze biologiche con una necessità di routine e diversi esperimenti di imaging a un costo ridotto e spazio rispetto a costruire microscopi separati per scopi individuali.
Introduction
Microscopi a fluorescenza sono strumenti importanti per la ricerca moderna scienza biologica e formazione immagine di fluorescenza è effettuata ordinariamente in molti laboratori di biologia. Applicando a biomolecole di interesse con fluorofori, possiamo direttamente visualizzarli sotto il microscopio e registrare i cambiamenti di tempo-dipendente nella localizzazione, conformazione, interazione e stato di assemblaggio in vivo o in vitro. Microscopi a fluorescenza convenzionali hanno una risoluzione spaziale di diffrazione limitata, che è ~ 200-300 nm in direzione laterale e ~ 500-700 nm in direzione assiale1,2e sono, pertanto, limitata a imaging presso il 100s di scala di nanometri micron. Al fine di rivelare i dettagli più fini nell’organizzazione o assemblaggio molecolare, sono stati sviluppati vari microscopie SR che possono rompere il limite di diffrazione. Strategie utilizzate per raggiungere SR includono effetti ottici non-lineari, quali emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia3,4 e illuminazione strutturata microscopia (SIM)5,6, 7, stocastico rilevazione di singole molecole, come ricostruzione ottico stocastico microscopia (tempesta)8 e fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM)9e una combinazione di entrambi, ad esempio MINFLUX10. Tra questi microscopie SR, microscopi SR basati sul rilevamento di singola molecola possono essere relativamente facilmente modificate da un set-up di microscopio di singola molecola. Con attivazione ripetitiva e la formazione immagine di proteine fluorescenti fuse (FPs) o coloranti foto-commutabile uploaded biomolecole di interesse, la risoluzione spaziale può raggiungere 10-20 nm11. Per ottenere informazioni sulle interazioni molecolari e conformazionale dinamica in tempo reale, angstrom-nanometri risoluzione è necessaria. smFRET12,13 è un approccio per ottenere questa risoluzione. Generalmente, a seconda le questioni biologiche di interesse, sono necessari metodi di formazione immagine con risoluzioni spaziali diverse.
In genere, per ogni tipo di imaging, configurazione ottica eccitazione e/o emissione specifica è necessaria. Per esempio, uno dei metodi più comunemente utilizzati illuminazione per il rilevamento di singola molecola è attraverso la riflessione interna totale (TIR), in cui un angolo specifico di eccitazione deve essere ottenuta attraverso un prisma o attraverso la lente dell’obiettivo. Per il rilevamento di smFRET, le emissioni da donatore e accettore coloranti devono essere spazialmente separate e diretto a diverse parti del elettrone-moltiplicando, charge coupled device (EMCCD), che può essere raggiunto con una serie di specchi e dicroico beam splitter inseriti nel percorso di emissione. Per tridimensionale (3D) SR imaging, un componente ottico, come una lente cilindrica14, è necessario per causare un effetto di astigmatismo nel percorso di emissione. Pertanto, autocostruito o commercialmente disponibile integrati microscopi sono, solitamente, funzionalmente specializzati per ogni tipo di metodo di imaging e non sono flessibili per passare tra diversi metodi di formazione immagine sull’assetto stesso. Qui presentiamo un sistema ibrido conveniente, che fornisce opzioni regolabili e riproducibili tra tre diversi metodi di imaging: imaging convenzionale di epi-fluorescente con diffrazione limitata risoluzione, singola molecola basata su rilevazione SR Imaging e rilevazione di singola molecola multi-colore, compresi smFRET imaging (Figura 1A). In particolare, il set-up presentato qui contiene accoppiati in fibra laser input per l’eccitazione di multi-colore e programmato un braccio commerciale illuminazione sul sentiero di eccitazione, che permette di controllo dell’angolo di eccitazione, per passare da epi-modalità e TIR. Nel percorso di emissione, una cassetta di lente cilindrica autocostruito rimovibile viene inserita all’interno del corpo del microscopio per l’imaging 3D SR e un divisore di fascio commerciale viene inserito prima di una macchina fotografica EMCCD che possa essere abilitata in modo selettivo per rilevare più canali di emissione contemporaneamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo sistema di microscopio ibrido Elimina la necessità di acquistare più microscopi. Il costo totale per tutte le parti, compresa la tabella ottica, tabella installazione manodopera, software e workstation, è circa 230.000 $. Custom lavorati parti, tra cui la mag lente e lente 3D, un costo di circa $700 (il costo dipende da veri e propri addebiti presso diversi istituti). Tipico commercialmente disponibili sistemi integrati per la microscopia SR basati sul rilevamento di singola molecola costato più di $300.000 ~ …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. riconosce sostegno dal programma di studiosi di Searle e il direttore di NIH nuovo Innovator Award. Gli autori riconoscono utili suggerimenti dal laboratorio di Paul Selvin (Università dell’Illinois, Urbana-Champaign) per il posizionamento della lente 3D.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Riferimenti
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
