Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop
Summary
Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.
Abstract
Fluorescentie microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen in situ ontdekken en hun dynamiek en interactie in real-time controleren. Naast conventionele epi-fluorescentie microscopie, zijn verschillende beeldvormende technieken ontwikkeld om specifieke experimentele doelen te bereiken. Enkele van de meest gebruikte technieken omvatten single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET), die conformationele veranderingen en moleculaire interacties met angstrom resolutie en single-molecuul detectie gebaseerde rapporteren kan Super resolutie (SR) imaging, die de ruimtelijke resolutie van ongeveer tien tot twentyfold in vergelijking met diffractie-limited microscopie verbeteren kan. Hier presenteren we een klant ontworpen geïntegreerd systeem, dat wordt samengevoegd meerdere beeldvormende methoden in een Microscoop, met inbegrip van conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde SR imaging en Multi-Color single-molecuul detectie, inclusief smFRET imaging. Verschillende beeldvormende methoden kunnen gemakkelijk en reproducibly worden bereikt door over te schakelen van optische elementen. Deze set-up is eenvoudig te nemen door een onderzoekslaboratorium dat in de biologische wetenschappen met een behoefte aan routine en gevarieerde beeldvorming experimenten op een lagere kosten en ruimte ten opzichte van de bouw van aparte microscopen voor individuele doeleinden.
Introduction
Fluorescentie microscopen zijn belangrijke hulpmiddelen voor de moderne biologische wetenschap onderzoek en fluorescerende imaging wordt routinematig uitgevoerd in vele biologie laboratoria. Door biomoleculen van belang met fluorophores te labelen, kunnen we direct visualiseren ze onder de Microscoop en de tijd-afhankelijke wijzigingen vastleggen in lokalisatie, conformatie, interactie, en vergadering staat in vivo of in vitro. Conventionele fluorescentie microscopen hebben een ruimtelijke resolutie van diffractie-limited, die daarom ~ 200-300 nm in de laterale richting en ~ 500-700 nm in de axiale richting1,2, en zijn beperkt tot de beeldvorming op de 100s van nanometer-naar-micron schaal. Om te onthullen fijnere details in de moleculaire assembly of organisatie, hebben verschillende SR-microscopies die de diffractie-limiet breken kunnen ontwikkeld. Strategieën gebruikt om SR omvatten niet-lineaire optische effecten, zoals de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie3,4 en gestructureerde verlichting microscopie (SIM)5,6, 7, stochastische detectie van afzonderlijke moleculen, zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)8 en photoactivated lokalisatie microscopie (PALM)9, en een combinatie van beide, zoals MINFLUX10. Onder deze microscopies SR, kunnen single-molecuul detectie gebaseerde SR microscopen relatief moeiteloos worden gewijzigd van een single-molecuul Microscoop set-up. Met de activering van de repetitieve en beeldvorming van photoactivatable fluorescente proteïnen (FPs) of foto-schakelbare kleurstoffen getagd op biomoleculen van belang, is ruimtelijke resolutie 10-20 nm11bereikbaar. Om te krijgen informatie over de moleculaire interacties en conformationele is dynamiek in real-time, angstrom-naar-nanometer resolutie vereist. smFRET12,13 is een benadering om deze oplossing te bereiken. In het algemeen, zijn afhankelijk van de biologische kwesties van belang, beeldvormende methoden met verschillende ruimtelijke resoluties nodig.
Meestal is voor elk type voor imaging, specifieke excitatie en/of emissie optische configuratie nodig. Bijvoorbeeld, is een van de meest gebruikte verlichting methoden voor single-molecuul detectie door middel van totale interne reflectie (TIR), waarin een specifieke excitatie hoek moet worden bereikt door middel van een prisma of door middel van het objectief. Voor de detectie van de smFRET moeten emissies van zowel donor als acceptor kleurstoffen worden ruimtelijk gescheiden en gericht op verschillende delen van het elektron-te vermenigvuldigen, charge – coupled apparaat (EMCCD), die kan worden bereikt met een set van spiegels en dichroïde beam splitters Geplaatst in het pad van de emissie. Voor driedimensionale (3-D) is SR imaging, een optische component, zoals een cilindrische lens14, nodig om een astigmatisme effect te veroorzaken in het pad van de emissie. Daarom, EIGENBOUW of verkrijgbare geïntegreerde microscopen, meestal, functioneel gespecialiseerd zijn voor elk type van imaging methode en zijn niet flexibel om te schakelen tussen verschillende beeldvormende methoden op de zelfde set-up. Hier presenteren we een kosteneffectieve, hybridesysteem waarmee verstelbaar en reproduceerbare Hiermee schakelt u tussen drie verschillende beeldvormende methoden: conventionele epi-belichting fluorescerende beeldbewerking met diffractie-beperkte resolutie, single-molecuul detectie gebaseerde SR beeldbewerking en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van smFRET imaging (figuur 1A). In het bijzonder de hier gepresenteerde set-up bevat vezel-gekoppelde ingang lasers voor Multi-Color excitatie en een commerciële verlichting arm in het pad van excitatie, waardoor geprogrammeerd controle van de excitatie-hoek, om te schakelen tussen epi-modus en TIR. In het pad van de emissie, een verwisselbare EIGENBOUW cilindrische lens cassette is geplaatst binnen het lichaam van de Microscoop voor 3D-SR imaging en een commerciële balk splitter is geplaatst voor een EMCCD-camera die kan selectief worden ingeschakeld om te detecteren van meerdere kanalen van de emissie tegelijkertijd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze hybride Microscoop systeem elimineert de noodzaak voor de aankoop van meerdere microscopen. De totale kosten voor alle onderdelen, inclusief de optische tabel, tabel installatie arbeid, software en werkstation, is ongeveer 230.000 dollar. Aangepaste-machinaal bewerkte onderdelen, inclusief de mag lens en 3D-lens, kost ongeveer $700 (de kosten hangt af van de werkelijke kosten bij verschillende instituten). Typische verkrijgbare geïntegreerde systemen voor single-molecuul detectie gebaseerde SR microscopie meer dan …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. erkent steun van het programma van de geleerden Searle en van de directeur van de NIH New Innovator Award. De auteurs erkennen nuttige suggesties van Paul Selvin de lab (Universiteit van Illinois, Urbana-Champaign) voor het plaatsen van de 3D-lens.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Riferimenti
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
