לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.
Abstract
ניתן לנטר את הפעילות החשמלית של תאי ברקמות בטכניקות אלקטרופיזיולוגיות, אך אלה הם בדרך כלל מוגבל לניתוח של תאים בודדים. מאז עלייה של תאיים סידן (Ca2 +) ציטוזול מתרחש לעיתים קרובות בגלל הפעילות החשמלית, או בתגובה מספר עצום של גירויים אחרים, תהליך זה יכול להיות במעקב על ידי ההדמיה של תאים נטען עם פלורסנט סידן רגיש צבענים. עם זאת, קשה תמונה תגובה זו בסוג של תא בודד בתוך רקמת כל כי צבע אלה נתפסות על ידי כל סוגי תאים בתוך הרקמה. לעומת זאת, סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים (GECIs) יכול לבוא לידי ביטוי על ידי סוג של תא בודד, לזרוח בתגובה לעליה של תאיים Ca2 +, וכך מאפשר ההדמיה של Ca2 + איתות של אוכלוסיות שלמות של סוגי תאים בודדים. כאן, אנו מיישמים את השימוש של GECIs GCaMP3/6 לצומת neuromuscular העכבר, תאי שוואן סינפסה התלת-צדדי בין מוטורי לגלוקוז, שרירי השלד מסוף/perisynaptic. נדגים את התועלת של טכניקה זו קלאסי שמחוץ רקמות ההכנות. שימוש של הפיצול אופטי, אנו מבצעים הדמיה כפולה באורך הגל של Ca דינמי2 + אותות ותווית סטטי של צומת עצב-שריר (NMJ) בגישה זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לפקח על שני GECI תא ספציפי או מתח מקודדים גנטית אינדיקטורים (GEVI) בו זמנית. לבסוף, נדון את רוטינות המשמש ללכידה מפות מרחביות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. יחד, טכניקות אלו אופטי, מהונדס, אנליטית יכול להיות מועסק ללמוד את הפעילות הביולוגית של subpopulations תאים נפרדים ב- NMJ במגוון רחב של הקשרים.
Introduction
NMJ, כמו כל הסינפסות, מורכב משלושה אלמנטים: מסוף presynaptic נגזר תא עצב, תא נוירון postsynaptic/אפקטור, ותא perisynaptic גליה1,2. בעוד ההיבטים הבסיסיים של ההעברה הסינאפסית היו שהראו-זה סינפסה3, היבטים רבים של תהליך זה נשאר לא ידוע, בחלקו בשל הביטוי של מולקולות אותו על ידי אלמנטים הסלולר ברורים של סינפסה הזה. לדוגמה, קולטני פורין אדנין נוקלאוטיד ATP והן אצטילכולין (ACh), אשר פורסם במשותף על ידי מנוע נוירונים ב- NMJ חוליות, באים לידי ביטוי על ידי שריר, תאי שוואן מוטורי לגלוקוז, ובכך שמסבך את הפירוש של כל השפעה תפקודית שהופעל על ידי אלה חומרים (למשל, משדר השחרור או תגובה, יצירת כח השריר)4. יתר על כן, למרות NMJ מרכיבי ה-tripartite פשוטים בהשוואה, לדוגמה, נוירונים במערכת העצבים המרכזית אשר לעתים קרובות להפגין תשומות סינפטית מרובים, אם המנוע נוירונים, תאי שריר או תאי שוואן להשתנות בתגובה לגירויים מבוסס על מהותי שלהם הטרוגניות (למשל, נגזרת עובריים, סוג של סיבים, מורפולוגיה) אינו ברור. על מנת לטפל בכל הבעיות הללו, זה יהיה יתרון לאתר בו זמנית את התגובה של תאים רבים בתוך אחד רכיב סינפטית, כמו גם מסלול, באותו הזמן, תגובה כזו גם שאר הרכיבים נפרדים. אסטרטגיות המקובלת באמצעות צבעם למדוד סידן איתות לא יכול להשיג שתי מטרות אלה, בגלל צבע שהוחל אמבטיה הוא נלקח על ידי סוגי תאים מרובים לאחר היישום לרקמות, צבע טעון intracellularly יכול לשמש רק לדמיין גדודים נפרדים או קטן של תאים. כאן, ניצול העכברים הטרנסגניים לבטא GECIs תוכנן כדי למדוד סידן לתא ספציפי איתות, יחד עם הדמיה ספציפית, כלי תוכנה5, אנחנו מדגימים הראשון של אלה שתי מטרות הכוללת ונדון כיצד התוספת של חדש כלים הטרנסגניים יעזור להשיג השני. טכניקה זו יהיה שימושי עבור מי שמעוניין מעקב אחר הדינמיקה סידן או אחרים הסלולר איתות האירועים נצפות דרך גן מקודד חיישנים אופטיים אוכלוסיות תאים מרובים בו-זמנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מספקים דוגמאות של מדידת Ca2 + תגובות תאים מסוימים ברקמת עצב-שריר שלם, שימוש בעכברים לבטא GECI. על מנת לבצע בהצלחה ניסויים אלה, זה הכרחי כדי לא לפצוע את עצב הסרעפת בזמן. לשיקוף Ca2 + תגובות בתאי שוואן בעוצמה נמוך או גבוה (כלומר, 20 X או 60 X), יש צורך להשתמש BHC או ממוצע-conotoxin חסום ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בכספים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) GM103554, GM110767 אל (T.W.G.) ומן המרכז הלאומי לחקר משאבי 5P20RR018751, את GM103513 8P 20 הלאומית המכון של כללי למדעי הרפואה (ל G.W.H.).
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
- Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
- Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
- Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
- Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
- Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
- Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
- Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
- Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
