궁의 분리 마우스 모델에서 병 변 크기의 비 침 투 적인 모니터링

Summary

여기, 선물이 붙일 레이블된 인간의 자궁내 막 조각 쥐에 투입의 라이브 이미징에 대 한 프로토콜. 메서드를 모니터링을 통해 endometriotic 병 변 크기에 선택의 약의 효과 실시간으로 형광 기자에 의해 방출 되는 형광의 정량화를 공부 하 고 수 있습니다.

Abstract

여기, 우리는 자궁내 막 증의 진행은 이식된 소성 인간의 자궁내 막 조직에 의해 방출 하는 형광의 비 침 투 적인 모니터링을 통해 실시간으로에서 평가 될 수 있다 분리 마우스 모델의 구현에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해 인간의 endometrium의 biopsies 기증자 여성의 지속적인 oocyte 기부에서 얻을 수 있습니다. 인간의 자궁내 막 조각 기자 형광 단백질 mCherry에 대 한 표현 cDNA를 설계 adenoviruses 존재 교양. 시각화, 시 감염 이후에 받는 사람 마우스에 이식에 대 한 선택 후 조직 형광의 최적의 속도 표시 합니다. 이식 수술 전에 1 주 받는 사람 마우스 oophorectomized는 고 estradiol 펠 릿은 피하 장애의 성장과 생존을 유지 하기 위해 됩니다. 수술 당일에 마우스는 교육-알바. 소형 (1.5 cm) 절 개를 통해 액세스 하는 마 취, 그리고 복 막 구멍 붙일 레이블된 임 플 란 트 tweezed, 짧게 접착제에 배어 있으며 복 층에 연결 된. 절 개 봉합은, 그리고 동물 며칠에 대 한 복구. Endometriotic 임 플 란 트에 의해 방출 하는 형광은 보통이 아닌 접촉 vivo에서 이미징 시스템으로 4 주 동안 3 일 마다 모니터링 됩니다. Endometriotic 임 플 란 트의 크기에서 유사 mCherry 신호 및 최대 형광 강도 보여주는 초기 시간 포인트에 대 한 정규화의 정량화 하 여 실시간으로 추정 될 수 있습니다.

궁의 모델의 전통적인 전 임상 설치류의 실시간으로 병 변 비-침략 적 모니터링을 허용 하지 않습니다 하지만 오히려 끝 지점에서 분석 하는 약물의 효과의 평가 허용. 이 프로토콜 실시간으로 병 변을 추적 하 수 하며 궁의 전 임상 모델에서 약물의 치료 가능성에 더 유용 합니다. 따라서 생성 된 모델의 주요 제한은 비-침략 적 모니터링은 불가능 episomal 표현의 광고 바이러스 시간이 오랜 기간 동안입니다.

Introduction

자궁내 막 증은 자 궁 구멍 밖에 기능 endometrium의 주입에 의해 시작 만성 부인과 질환 이다. 소성 병 변은 성장 하 고 만성 골반 통증 및 불 임¹선도 하는 염증 성 프로세스를 유도. 그것은 그를 생식 연령 여성의 10-15%에 영향을 받는 endometriosis2, 추정 이며 불 임 여성³의 약 40-50%에 존재. 자궁내 막 증에 대 한 현재 약물 치료 장애를 완전히 근절 수 없습니다 있으며 부작용^4,5의 자유로운. 보다 효율적인 치료에 대 한 연구는 인간의 병 변 적절 하 게 유사 수 있습니다, 그리고 다른 사람의 사이에서 병 변 크기에 화합물의 효과 밀접 하 게 평가 될 수 있다 그런 방법으로 자궁내 막의 기존 동물 모델의 구체화의 필요 합니다.

영장류 모델 이식 소성 병 변의 조직학 동일 여 고 인간^6,,78;에서 비슷한 사이트에서 궁을 모방 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 윤리적 우려와 높은 경제 비용 관련 영장류도 실험 그들의 사용⁹. 따라서, 궁의 비보에 모델의 구현에 대 한 작은 동물, 특히 설치류를 사용 하 여 개인^10,11의 더 큰 숫자와 함께 연구 수 있습니다 선호 하 고 있습니다. 궁 쥐 자 궁 뿔 (“동종 모델”)^12,13 의 조각 또는 소성 사이트 (분리 모델) 인간의 궁/endometriotic 조직을 이식 하 여이 동물에서 유도 될 수 있다¹⁴ . 인간, 달리 설치류 그들의 자궁내 막 조직 창 고 하지 않습니다 그리고 그로 인하여 궁 수 개발 되지 않을 자발적으로 이러한 수 종에. 따라서, 동종 마우스 사실은 소성 마우스 자 궁 조직 이식 모델 궁의 강평 되었다 인간 endometriotic 병 변¹⁵의 특성을 반영 하지 않습니다.

자궁내 막 증의 적절 한 생리학 신선한 인간의 자궁내 막 조각 immunodeficient 동물에 이식 되는 궁의 분리 모델에 유사 수 있습니다. 기존의 분리 모델, 관심의 화합물의 치료 효과 일반적으로 끝점 캘리퍼스¹⁶의 사용으로 병 변 크기의 평가 의해 평가 됩니다. 분명 한계는, 따라서, 끝점 동물 모델을 허용 하지 않습니다 이식 역학 또는 시간이 지남에 endometriotic 병 변 개발 공부 이다. 추가 한계는 캘리퍼스를 사용 하 여 병 변 크기의 정확한 측정을 허용 하지 않는다는 것 이다. 실제로, 캘리퍼스에서 제공 하는 표준 오차에 따라서 크기에 실제 변화를 감지 하는 이러한 도구의 용량을 제한 하는 마우스에 이식 하는 병 변의 크기와 같은 범위 (예: 밀리미터)입니다.

이러한 한계를 극복 하기 위해 여기, 우리 기자 m-체리 형광 단백질을 표현 하 이식된 인간 조직 설계는 궁의 분리 마우스 모델의 생성을 설명 합니다. 적절 한 이미지 시스템으로 형광 신호 검출 실시간으로 그것의 크기의 동시 정량화와 병 변 상태 모니터링 비-침략 적 있습니다. 따라서, 우리의 모델에는 병 변 크기에 더 객관적이 고 변이의 정확한 평가 수행 하기 위해 실시간 비-침략 적 모니터링의 기회와 가능성을 제공로 서 기존의 끝점 모델에 비해 명확한 이점을 제공 합니다.

Protocol

인체 조직 표본 사용 기관 검토 위원회 병원 대학교 라 Fe의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 모든 환자 서 면된 동의 제공합니다. 동물 관련 연구 센트 드 Investigacion 프린시페 펠리페 데 발렌시아에서 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다 및 모든 절차 국립 보건원에서 관심과 포유류의 사용에 대 한 지침에 따라 수행 했다 건강. 1. 자궁내 막 조직 수집 및 전처리 <…

Representative Results

여기, 우리 비-침략 적 되므로 자궁내 막 증 병 변의 건축 immunocompromised 마우스에 붙일 레이블된 조각의 인간의 endometrium 이식 하 여 보존의 분리 모델을 만들기 위한 과정을 설명 병 변 진행의 모니터링. 자궁내 막 조각 레이블 명시적 mCherry, 가까운 적외선 영역에서 형광을 방출 하는 단백질을 설계 하는 아 데 노 바이러스와 감염에 의해 달성 된다. 그림 1</s…

Discussion

여기 상세한 프로토콜 있는 이식 병 변 아키텍처의 아키텍처는 보존 방출 동시에 실시간으로 형광의 평가 허용 하는 동안 mCherry에 의해 하는 자궁내 막의 동물 모델의 구현을 설명 합니다. 자궁내 막 조직 표시. 이 프로토콜에서 우리는 특정 vivo에서 이미징 시스템 및 비 접촉 레이블이 지정 된 병 변에서 방출 되는 형광을 평가 하기 위해 관련된 소프트웨어의 사용을 설명 합니다. 각 사용자는 특?…

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator