Katalytische Spülung der Anlage reaktive Sauerstoff Spezies In Vivo von anionischen Cerium-oxid-Nanopartikel
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Synthese und Charakterisierung von Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria) für ROS (reaktive Sauerstoffspezies) in Vivo, Nanoceria im Pflanzengewebe durch konfokale Mikroskopie und in-Vivo imaging Aufräumvorgang Überwachung des Nanoceria ROS Aufräumvorgang konfokalen Mikroskopie.
Abstract
Reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS)-Ansammlung ist ein Markenzeichen der Pflanze abiotischen Stress-Reaktion. ROS spielen eine Doppelrolle in Pflanzen als Signalmoleküle auf einem niedrigen Niveau und Moleküle auf einem hohen Niveau zu beschädigen. Anhäufung von ROS in gestresste Pflanzen kann Stoffwechselprodukte, Enzyme, Lipide und DNA, was zu einer Reduzierung des Pflanzenwachstums und der Ertrag beschädigen. Die Fähigkeit der Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria), katalytisch ROS in Vivo Aufräumen bietet ein einzigartiges Werkzeug zu verstehen und Biotechnologe Pflanzenverträglichkeit abiotischem Stress. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu synthetisieren und Poly (Acryl) Säure beschichteten Nanoceria (PNC) zu charakterisieren, Schnittstelle die Nanopartikel mit Pflanzen über Blatt-Lamina-Infiltration und Überwachung ihrer Verteilung und ROS Aufräumvorgang in Vivo konfokale mit Mikroskopie. Aktuelle Molekulare Werkzeuge zur Manipulation der ROS-Akkumulation in Pflanzen sind nur die Modell-Arten und mühsamer Wandel Methoden erfordern. Dieses Protokoll für in Vivo ROS Aufräumvorgang hat das Potenzial, zu Wildtyp-Pflanzen mit breiten Blättern und Blattstruktur wie Arabidopsis Thalianaangewendet werden.
Introduction
Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria) sind in lebenden Organismen, von der Grundlagenforschung zur Biotechnologie, aufgrund ihrer unterschiedlichen katalytischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Aufräumvorgang Fähigkeit1,2,3verbreitet. Nanoceria haben ROS Aufräumvorgang Fähigkeiten aufgrund einer großen Anzahl von Oberfläche Sauerstoff stellen, die abwechselnd zwei Oxidation Staaten (Ce3 + und CE-4 +) 4,5,6. Die CE-3 + baumelnden Bindungen Aufräumen effektiv ROS während der Gitter-Stämme im Nanobereich die Regeneration dieser defekt Seiten über Redox fördern-Reaktionen7Radfahren. Nanoceria haben auch vor kurzem verwendet, für das Studium und Engineering Anlagenbau Funktion8,9. Pflanzen unter abiotischen Stress erleben Anhäufung von ROS, oxidativen Schäden an Lipiden, Proteinen und DNA-10. In A. Thaliana Pflanzen führt Nanoceria katalytische Aufräumvorgang von ROS in Vivo zu verbesserten pflanzlichen Photosynthese unter hohen Licht, Wärme und Kühlung betont8. Anwendung Nanoceria auch erhöht Shooting Biomasse und Korn-Ertrag von Weizen (Triticum Aestivum)11Boden; Raps (Brassica Napus) Pflanzen mit Nanoceria behandelt haben höhere pflanzlicher Biomasse unter salzstress12.
Nanoceria bieten Bioingenieure und Biologen eine Nanotechnologie-basierte Tool, um abiotischem Stress-Reaktionen zu verstehen und zu verbessern Pflanzenverträglichkeit abiotischem Stress zu Pflanzen. Nanoceria der in Vivo ROS Aufräumvorgang Fähigkeiten sind unabhängig von Pflanzenarten und einfache Lieferung ins Pflanzengewebe hat das Potenzial, breite Anwendung außerhalb von Modellorganismen zu ermöglichen. Im Gegensatz zu anderen Methoden genetisch bedingt Nanoceria erfordern keine Generierung von Pflanzenlinien mit der Überexpression von antioxidativen Enzymen für höhere ROS Aufräumvorgang Fähigkeit13. Blatt-Lamina Infiltration von Nanoceria Pflanzen ist ein praktischer Ansatz für die Labor-basierte Forschung.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, (1) die Synthese und Charakterisierung von negativ geladenen Poly (Acryl) Säure Nanoceria (PNC), (2) die Lieferung und Verfolgung von PNC im gesamten Blattzellen und (3) die Kontrolle der PNC-fähigen ROS Aufräumvorgang beschreiben Vivo. In diesem Protokoll sind negativ geladenen Poly (Acryl) Säure Nanoceria (PNC) synthetisiert und charakterisiert durch ihr Absorptionsspektrum, hydrodynamische Durchmesser und Zetapotenzial. Wir beschreiben eine einfache Blatt Lamina Infiltration-Methode um PNC in Pflanze Blatt Gewebe liefern. Für die in-Vivo Bildgebung der Verteilung der Nanopartikel im Mesophyll Zellen wurde ein Fluoreszenzfarbstoff (DiI) zur PNC (DiI-PNC) beschriften und beobachten die Nanopartikel über konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Schließlich erklären wir, wie in Vivo PNC ROS Abfangen durch konfokale Mikroskopie zu überwachen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir PNC Synthese, Charakterisierung, Fluoreszenzfarbstoff Kennzeichnung und konfokale Imaging der Nanopartikel im Mesophyll Pflanzenzellen ihre in Vivo ROS Aufräumvorgang Aktivität aufweisen. PNC werden aus einer Mischung von Cerium Nitrat und Ammonium Hydroxid-PAA Lösung synthetisiert. PNC zeichnen sich durch Absorption Spectrophotomery und die Konzentration über Bier-Lamberts Gesetz ermittelt. Zeta mögliche Messungen bestätigt die negativ geladene Oberfläche des PNC zur V…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der University of California, Riverside und USDA nationalen Institut für Lebensmittelwissenschaften und Landwirtschaft, Luke Projekt 1009710 JPG unterstützt. Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation unter Grant Nr. 1817363 zu JPG
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
Riferimenti
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson’s disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
