Summary
Her beskriver vi en protokol for immunisering af de voksne zebrafisk (Danio rerio) med en DNA-baseret vaccine og demonstrere validering af en vellykket vaccination begivenhed. Denne metode er velegnet til præklinisk screening af vaccine kandidater i forskellige infektion modeller.
Abstract
Interessen for DNA-baserede vaccination er steget i løbet af de seneste to årtier. DNA vaccination er baseret på kloning af en sekvens af en valgte antigen eller en kombination af antigener i et plasmid, som gør det muligt for en skræddersyet og sikker design. Administration af DNA-vacciner i værtsceller fører til ekspression af antigener, der stimulerer både humorale og celle-medieret immunrespons. Denne rapport beskriver en protokol for kloning af antigen sekvenser i pCMV-EGFP plasmid, voksen zebrafisk vaccination med vaccine kandidaterne ved intramuskulær mikroinjektion, og den efterfølgende elektroporation at forbedre indtagelsen. Vaccineantigener er udtrykt som grøn fluorescerende proteiner (NGL)-fusion proteiner, som giver mulighed for bekræftelse af antigen udtryk under UV-lys fra levende fisk og kvantificering af udtryk niveauer af fusion protein med ELISA, såvel som deres registrering med en western blot analyse. Den beskyttende effekt af vaccinen kandidater er testet ved at inficere fisk med Mycobacterium marinum fem uger postvaccination, efterfulgt af kvantificeringen af bakterier med qPCR fire uger senere. I forhold til pattedyr præklinisk screening modeller, giver denne metode en omkostningseffektiv metode til den indledende screening af nye DNA-baserede vaccine kandidater mod en mykobakterielle infektioner. Metoden kan anvendes yderligere til screening DNA-baserede vacciner mod forskellige bakterielle og virale sygdomme.
Introduction
De første DNA-vaccine undersøgelser blev udført i 1990s1, og siden da, er blevet testet DNA vacciner mod forskellige smitsomme sygdomme, kræft, autoimmunitet og allergi2. I pattedyr, en DNA-vaccine mod West Nile virus hos heste og en terapeutisk kræft vaccine for canine mundtlig melanom er blevet licenseret, men disse er ikke i øjeblikket i klinisk brug2. Ud over den interesse, der er fremkaldt af pattedyr undersøgelser, har DNA vaccination viste sig for at være en praktisk måde at immunisere opdrættede fisk mod virussygdomme. En vaccine mod fisk infektiøs hæmatopoietisk nekrose virus (IHNV) har været i kommerciel brug siden 2005, og en vaccine mod infektiøs pankreasnekrose virus (IPNV) blev for nylig godkendt3. Derudover udvikles flere DNA-vacciner mod fisk patogener.
Som traditionelle vacciner indeholder ofte inaktiveret eller levende svækkede patogener, udgør de en potentiel risiko for overførsel af sygdommen2. DNA vacciner, til gengæld hindre denne risiko, som de er baseret på forvaltningen af plasmid kodning bakteriel eller viral antigener, snarere end hele patogenet, selv2,4. DNA vacciner er produceret med DNA rekombination teknikker, som giver mulighed for den præcise udformning af vaccineantigener og fleksibel formulering af antigen kombinationer og adjuvanter i en enkelt vaccine konstruere5. Derudover er produktion af DNA vacciner hurtigere, lettere og mere omkostningseffektiv end protein-baserede rekombinante vacciner, som er en stor fordel for vaccine kandidat screening formål, men også, for eksempel, i tilfælde af pandemisk udbrud 2.
I fisk, de mest almindelige administrationsveje for DNA-vacciner er intraperitoneal, intramuskulær og mundtlige3,6,7, mens i pattedyr, subkutane og intradermal ruter er yderligere indstillinger2. Efter en intramuskulær injektion, administrated DNA plasmider angive celler på administrationswebstedet (fx., for det meste myocytes, men også bosat antigen-præsenterer celler [PMV'er]). Andelen af transfekteret celler kan forøges betydeligt ved elektroporation2,8. Efter indtastning af cellen, træder nogle plasmid DNA atomkernen, hvor gener kodet af plasmidet er transskriberede2. I denne protokol benytter vi den pCMV-EGFP plasmid, der har en stærk allestedsnærværende promotor optimeret til eukaryote udtryk9. I denne konstruktion oversættes antigener som en fusion protein med en normal god landbrugspraksis. Normal god landbrugspraksis muliggør bekræftelse af en vellykket vaccination og den korrekte antigen vare af den simple visualisering af antigen udtryk med et fluorescens mikroskop i levende fisk.
I pattedyr, har DNA vacciner vist sig at stimulere forskellige typer af immunrespons afhængigt af transfekteret celle typer2,5. Transfekteret myocytes udskiller antigener i det ekstracellulære rum eller frigive dem ved celledød, og antigener opslugt af PMV'er er, efterfølgende, præsenteret på store histocompatibility komplekse II molekyler2. Dette udløser CD4 og CD8 T celle svar, især ud over B-celle svar2,5,10. I fisk, er T og B lymfocytter samt dendritiske celler (DCs), blevet identificeret, men deres arbejdsdeling i antigen præsentation er mindre godt forstået11. Zebrafisk DCs, dog har vist sig at dele bevarede fænotypiske og funktionelle egenskaber med deres pattedyr modparter12. Derudover har DNA vaccination vist sig at fremkalde lignende immunrespons i fisk og pattedyr, herunder T og B-celle svar6,13,14,15,16 .
Både larver og voksne zebrafisk er almindeligt anvendt til model forskellige smitsomme sygdomme, såsom fisk M. marinum infektion model af tuberkulose i denne protokol17,18,19,20 ,21,22. I forhold til pattedyr modelorganismer, fordelene ved zebrafisk omfatter deres lille størrelse, hurtig reproducerbarhed, og lave boliger udgifter23. Disse aspekter gør zebrafisk en ideel dyremodel for omfattende præklinisk screening undersøgelser for innovative vacciner og lægemiddelsammensætninger23,24,25.
I denne protokol beskrive vi, hvordan romanen vaccineantigen kandidater mod mycobacteriosis kan vurderes af DNA-baserede vaccination af voksen zebrafisk. Først beskriver vi, hvordan antigener er klonet i pCMV-EGFP udtryk plasmid, efterfulgt af en detaljeret protokol til intramuskulær injektion af vaccine plasmider og den efterfølgende elektroporation i musklen. Udtryk for hver antigen er bekræftet af Fluorescens mikroskopi uges postimmunization. Effekten af antigen kandidater er derefter testet af eksperimentelt inficerer vaccinerede fisk med M. marinum.
Protocol
Forsøg herunder voksen zebrafisk kræver en tilladelse til dyreforsøg for både på vaccination og de efterfølgende undersøgelser med smitte-model. Alle metoder og eksperimenter beskrevet her er godkendt af dyr eksperiment bestyrelsen af Finland (ESAVI) og undersøgelserne, der gennemføres i overensstemmelse med EU direktiv 2010/63/EU.
1. kloning af DNA vaccineantigener
- Vælg et udtryk plasmid optimeret til eukaryote udtryk for antigen(s) af interesse under en stærk, konstitutive promoter, såsom cytomegalovirus (CMV) øjeblikkelig tidlig fortaler. For at aktivere i vivo verifikation af antigen udtryk, skal du vælge en vaccine plasmidet, som koder en fluorescerende tag, pCMV-EGFP plasmid9 i denne protokol.
- Brug passende web-baseret og bioinformatic værktøjer til at vælge en potentielt immun-beskyttende antigen sekvens (eller flere sekvenser) af ca 90-600 nt (30 – 200 aa)26 fra molekylærgenetisk-af-interesse af det patogen, der skal bruges i den efterfølgende infektion model.
- Bruge tilgængelige software, eller manuelt design primere til at forstærke antigen gener fra patogenet genom og at klone antigen sekvens(er) til webstedet flere-kloning af udtryk plasmid. Sørg for at bevare korrekt læsning rammen, når du vælger antigenet.
- Omfatte både en Kozak sekvens (CCACC)27 og en start codon (ATG) i 5' primer. For at bevare den C-terminale EGFP tag, undgå mellemliggende stop kodon (TAG, TAA, TGA) i antigen sekvens og 3' primer. Også sikre, at normal god landbrugspraksis tag forbliver i den samme læsning ramme med antigen af interesse.
- Bruge RNA eller DNA udvundet af patogenet som en skabelon til at generere en tilstrækkelig mængde af PCR produkt med kloning primere. Helst, bruge en korrekturlæsning DNA polymerase til at bevare den korrekte antigen sekvens.
- Rense PCR produkt og kontrollere den korrekte størrelse af produktet ved gelelektroforese. Fordøje og ligate PCR produktet med fordøjet vaccine plasmid.
- Omdanne kompetente bakterieceller efter en egnet protokol ligatur mix. Brug en passende antibiotika valg for positive kolonier og plasmid produktion i E. coli; plasmidet pCMV-EGFP for eksempel, indeholder et ampicillin-resistens gen for dette.
- Bruge Sanger sekventering at bekræfte indsættelsen af den korrekte antigen sekvens. De følgende primere kan bruges til sekvensering antigener i pCMV-EGFP plasmid: CMV frem 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 'og EGFP-N bak 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'.
- Producere og rense en tilstrækkelig mængde af vaccine-konstruktionen. Opløses eller elueres plasmid i sterilt vand. Sørg for at produceret plasmid DNA er af høj kvalitet og koncentration er mindst 0,72 µM eller 2.000 ng/µL.
2. trække mikroinjektion nåle
- Forberede mikroinjektion nåle på forhånd. Brug 10 cm aluminiumsilikat glas kapillærer. Bemærk at borsilikatglas kapillærer er for skørt for indsprøjtning voksne fisk.
- Trække nåle med en mikropipette-nål-opdigte enhed.
Bemærk: Nålene skal ligne en præsenteret i figur 1. Med den enhed, der bruges i denne protokol (Table of Materials), resultere følgende indstillinger i den ønskede form for nåle:- Sæt glasset kapillær i V-fuge i baren aftrækker og stramme klemmer knop let.
- Flytte indehaveren ved siden af glødetråden og forsigtigt skubbe kapillær gennem glødetråden i puller bar på anden siden af glødetråden. Undgå at berøre glødetråden med kapillar.
- Stramme klemmer knapper, fastsatte splintfrit glas, og tryk på knappen pull.
Forsigtig: Glødetråden er varmt.
- Læg nålene på et stykke af genanvendelige klæbemiddel inde i en 15-cm petriskål plade til at beskytte nål tips. Holde skålen dækkes for at holde nålene ren.
3. udfylde mikropipette nåle
- Forberede vaccine mix. Bruge 0,5 – 12 µg af plasmidet pr. dosis. Hvis der kombinerer flere forskellige plasmider i én vaccination blanding, bruge en maksimal samlet DNA koncentration af 12 µg pr. fisk.
- Beregne omfanget af vaccine "master mix" afhængig af antallet af fisk i hver gruppe (se nedenfor). Tilføje 1 µl sterilt-filtreret phenol rød til hver injektion dosis til lette både påfyldning af kapillar nåle og observation af injektion. Tilføje sterile 1 x PBS op til en maksimal samlet maengde paa 5 – 7 µl i én injektion dosis8.
Bemærk: Injektionsvolumener højere end 7 µL kan resultere i lejlighedsvise udsivning af injektion løsning og bør derfor undgås. - Placer et stykke tape, lim side op, på en passende holder, for eksempel, siden af en tom tip box. Forsigtigt lægger kapillær nålene på båndet.
- Med pipette overfoeres højst 7 µL af vaccine-mix på et stykke af laboratoriet film. Ved hjælp af en loading tip, overføre vaccinen fra filmen til nålen. Med pipette overfoeres langsomt og forsigtigt, undgå pipettering luftbobler i nålen.
- Lad nålene nøjes med 15-30 min at fjerne eventuel tilbageværende små luftbobler.
4. fastsættelse af Microinjector og Electroporator for immunisering
- Angive en micromanipulator og en lyskilde i den rigtige position. Skifte luft trykudtaget til åben position.
- Justere parametrene for den pneumatiske pumpe (Se også figur 2) som følger.
- Indstille udluftningsanordning knop på Skub ud-porten til hold for at forhindre opfyldning af pipetten kapillaritet. Sæt slangen fra skub ud-porten til mikropipette. Brug ikke vakuum port i denne protokol.
- Justere puls længden: bruge timet tilstand, hvor en elektronisk timer bestemmer varighed af den pres magnetventil forbliver åben. Kontroller, at den grønne lampe ved siden af Eject trykmåler lyser når pres magnetventil er åbne (energi).
- Sæt puls interval til 10 s; med denne indstilling, pulserne kan yderligere indstilles fra 100 ms til 10,1 s. Brug den 10-turn periode ringe til finjustering puls længden — hver tur af skiven er 1,0 s. Hvis det er nødvendigt, kan dette også justeres under en indsprøjtning.
- Bruge pulse initiativtager ("Opståen knap") på frontpanelet af pneumatiske pumpen, eller en ekstern fodkontakt (anbefales). Dette er forbundet med pneumatisk pumpen frontpanel.
- Sætte nålen på mikropipette indehaveren af micromanipulator. Skåret spidsen af nålen med pincet, så væske kan skubbes, og bruge mikroskop til at se den korrekte position. Tryk på fodkontakten engang for at se, at en 1-s puls skubber en lille dråbe ud af nålen.
- Brug følgende indstillinger til electroporator: spænding = 40 V; puls længden = 50 ms, antal pulser = 6. Tilslut pincet til electroporator. Se, at den faktiske spænding og puls længden vist på monitoren ikke afviger væsentligt fra indstillingerne.
5. indsprøjtning af DNA-Vaccine og elektroporation
- For immuniseringer efter denne protokol, brug sunde, 6 til 12 måned-forhenværende voksen zebrafisk. Holde fisk i en gennemstrømnings-system med en 14/10 h lys/mørke cyklus, med et maksimum på syv fisk per 1 L vand.
- Forberede 0,02% 3-aminobenzoic syre ethyl ester (tricaine) opløsning (pH 7) i tank vand bedøve fisk28. Bruge en 10 cm petriskål eller noget lignende.
- Forberede en recovery tank ved at udfylde en 5 L bægerglas med 3 L ren system vand.
- Forberede en vaccination polstring for at holde fisk i en fast position under vaccination. Tage en 5 x 7 cm2 stykke af en 2 til 3 cm tykke svamp. Skær en rille i svampen med en skalpel blade eller skarpe saks.
Bemærk: Den samme vaccination polstring kan bruges i flere forsøg. Desinficere svamp mellem eksperimenter af gennemvædning det i 70% ethanol og lad tørre. - Grundigt blød svamp i system vand og sæt svampen på en petriskål.
- Fast fisk 24 timer før vaccinationerne.
- Bedøver en zebrafisk ved at placere det på en petriskål, som indeholder 0,02% tricaine. Vent indtil fisken ikke reagerer touch stimulation, og indtil der er ingen bevægelse af gællerne. Bedøver en enkelt fisk ad gangen.
- Bruge en plastikske, overføre den bedøvede zebrafisk på den våde svamp og angive fiskens ventrale side i rillen. I den korrekte position, sikre, at hovedet og de fleste af kroppen af fisken er inde i groove og rygfinne og halen stikker ud fra rillen.
- Under mikroskop, forsigtigt lægge nålen i en cirka 45° vinkel tæt på den zebrafisk ryggens muskler, benytter den x - og y - aksen finjustering hjul på micromanipulator.
- Find den lille plet uden skæl foran rygfinnen, hvor skubbe nålen ikke kræver kraft. Hvis modstand er følte, prøv en tilstødende spot. Undgå at beskadige ryggen, rygfinnen eller skalaer.
Bemærk: Hvis nålen bøjninger mens skubbe, forkorte nålen lidt ved at skære det. - Brug fodkontakten til at gradvist injicere vaccine løsning i musklen. Observere injektion gennem mikroskop: phenol rød er synlig, da den går ind i muskelvævet. Justere varigheden af pulsen, hvis nødvendigt.
Bemærk: Alternativt bruge pulse initiator-knappen på frontpanelet af pneumatiske pumpen til injektion. Men tillader brug af en ekstern fodkontakt ved hjælp af anden side for justering af puls længden af 10-turn dial hjulet. Undgå indsprøjte løsning for hurtigt, da dette kan forårsage overdreven vævsskader. Sørg for ikke at injicere luft. - Electroporate fisk umiddelbart efter injektion. Sørg for, at fisken er stadig under bedøvelse. Holde fisken på svamp og sæt fisk mellem pincet-type elektroder, således at elektroderne er placeret på hver side af injektionsstedet. Ikke trykker elektrode pincet for stram, men holde begge elektroder i kontakt med fisk.
- Tryk på startknappen på electroporator at give seks 40 V, 50 ms pulser.
- Forsigtigt overføre fisk til recovery tank.
- Ren elektroderne efter hver elektroporation ved at aflæse dem med 70% ethanol.
Bemærk: Omhyggeligt overvåge fiskenes velfærd efter vaccinationen. Aflive en fisk, der udviser tegn på ubehag (en langsom genopretning fra anæstesi, afvigende svømning, gispende) i 0,04% tricaine. Efter inddrivelsen overføre fisk til gennemstrømnings-enhed og fodre den normalt.
6. visualisering og billeddannelse af Antigen udtryk
- Bedøver fisk i 0,02% tricaine 2-7 dage efter vaccination, og bruge en UV-lys til at se EGFP udtryk i nærheden af injektionsstedet.
Bemærk: Visuel inspektion under en UV-lys er en nem og ikke-invasiv operation, der er egnet til rutinemæssig kontrol af vellykket vaccinationer, også i storskalaforsøg. Hvis ingen billeder af fisken er påkrævet, kan dette trin også udføres i almindelige fisk tanke uden at skulle bedøver eller flytte fisk. - For at fange billeder, skal du bruge et fluorescens mikroskop til at visualisere EGFP udtryk ved indsprøjtning arbejdsplads8. Bruge en 2 X mål linse og vælg det korrekte filter til at visualisere fluorescens eller synligt lys synspunkter.
- Holde den bedøvede fisk stadig ved at trykke på den ventrale fin forsigtigt med en pincet mod en petriskål bund. Tage både lys-mikroskop og fluorescens billeder af det samme område.
- Flette lys-mikroskop og fluorescens billeder ved hjælp af passende software29. Tilføje en skalalinjen.
7. kvantificering af udtryk niveau og størrelsen af antigener
- Aflive fisk i 0,04% tricaine. Dissekere den fluorescerende del af ryggens muskler med en skalpel og pincet i UV-lys. Uddrag proteiner fra prøver8.
- Kontrollér den korrekte størrelse af in vivo-produceret proteiner med en western blot analyse, ved hjælp af en peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret normal god landbrugspraksis antistof (eller lignende)8. Omfatte en negativ kontrol (unimmunized fisk) for at udelukke enhver baggrund signaler og uspecifik bindende, en kontrol, at udtrykke EGFP uden en smeltet antigen.
Bemærk: Western blot analyse, den forventede størrelse (i kDa) af antigen-fusion proteiner kan beregnes, eksempelvis ved ligningen:
Molekylvægt (MW) dsDNA = (antallet af nukleotider x 607.4) + 157.9; eller ved hjælp af web-baserede værktøjer. - Kvantificere udtryk for hver antigen ved hjælp af en normal god landbrugspraksis-ELISA8 (valgfrit).
8. kombinere Vaccination protokollen med en M. marinum infektion Model
- Bestemme Gruppestørrelse kræves til pålidelig bestemmelse af effektiviteten af en roman vaccine kandidat i modellens infektion og analysen anvendte (Se for eksempel, Myllymaki mfl. 24 og Charan og Kantharia30). Foretage passende magt beregninger under planlægningen af forsøgene.
- For at evaluere effektiviteten af vaccine kandidater, inficere fisk 5 uger postimmunization. Bruge en intraperitoneal infektion med ca. 30 kolonidannende enheder (cfu) af M. marinum, hvilket fører til en latent infektion i de fleste fisk8,20,31.
Bemærk: Når du bruger M. marinum, følge et BSL2 sikkerhed protokol. Forberedelse af den bakterie eller virus afhænger af patogenet. - Kvantificere antallet af patogener i hver fisk. Aflive fisk 4 uger efter infektion og bestemme den bakterielle byrde i hver fisk fra den udpakkede DNA med qPCR ved hjælp af primere specifikke for M. marinum20,24.
Bemærk: Sørg for at indeholde en passende kontrolgruppe og bruge de korrekte statistiske metoder til at analysere resultaterne. Generelt, en gruppe af fisk immuniseret med tomme pCMV-EGFP plasmid er et egnet negativ kontrol. - Bekræfte positive resultater med antigener uden normal god landbrugspraksis. Klon antigener, som beskrevet i trin 1 og gentage vaccination eksperiment.
Representative Results
De forskellige trin i DNA vaccination protokollen af voksen zebrafisk er illustreret i figur 3. I første omgang, valgte antigen sekvenser er klonet i en pCMV-EGFP plasmid og plasmid DNA er produceret og renset24 (figur 3). Vaccine kandidater er derefter injiceres intramuskulært med en microinjector og injektionsstedet er electroporated at forbedre indtagelsen af plasmidet ind i cellerne (figur 3). Den anvendte vaccination dosis var optimeret ved indsprøjtning forskellige mængder af pCMV-EGFP plasmid og måle normal god landbrugspraksis udtryk med ELISA (tillægs figur 1). To til syv dage postvaccination, udtryk for fusion proteinet opdages under UV-lys og visualiseret med Fluorescens mikroskopi (figur 3 og figur 4). Udtrykket niveauer af forskellige antigener kan variere fra meget intensiv (antigen 1) til en svag udtryk (figur 4). Derudover normal god landbrugspraksis udtryk kan iagttages på tværs af den dorsale muskel (antigen 1) eller i et mere begrænset område (antigen 2) (figur 4). Men hvis ingen Fluorescens er opdaget inden for 10 dage, det anbefales at sørge for at der er ingen fejl i antigen kloning eller primer design. For at bekræfte, at det udtrykte fusion protein er af den korrekte størrelse, kan proteiner udvundet af muskelvæv omkring injektionsstedet og bruges til en western blot analyse.
Effekten af vaccine kandidater er evalueret af udfordrende fisk med en lav dosis af M. marinum ved en intraperitoneal injektion (figur 5). Fire til fem uger efter infektion bakteriel tæller er bestemt med qPCR og i forhold til bakteriel belastninger i kontrolgruppen (figur 5). Derudover effektiviteten af de mest lovende vaccine kandidater kan testes ved at overvåge overlevelse efter en høj dosis M. marinum infektion()figur 5). Men ud over at give en kvantitativ resultat på progression af infektion, i stedet for blot en status af levende eller døde, qPCR-baserede cfu kvantificering kræver mindre tid og mindre gruppe størrelser, og er derfor en mere etisk tilgang til en primær skærmen. Samlet set letter denne protokol screening af effektiviteten af roman vaccineantigener inden for 12 uger (figur 5).
Figur 1: Næroptagelse (12 X) af aluminiumsilikat nåle bruges i voksen zebrafisk intra muskuløs injektioner. Tip nedenfor er blevet skåret ned med en pincet og er klar til at blive brugt til microinjections. Dette tal er blevet tilpasset fra Oksanen35. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: mikroinjektion udstyr og set-up. Hovedbestanddelene af det nødvendige udstyr til DNA vaccination af voksen zebrafisk er fremhævet med fed skrift. De kritiske justeringer er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forberede DNA-vaccine plasmider og proceduren for immunisering. (1) markerede antigener er klonet støder op til normal god landbrugspraksis tag i pCMV-EGFP plasmid. (2) vaccine konstruktion er produceret mikrobiologisk, koncentreret og renset. (3) 12 µg af plasmid indsprøjtes i den dorsale muskel i en bedøvede voksen zebrafisk med en microinjector, og injektionsstedet er efterfølgende electroporated med seks 40-V, 50-ms impulser. (4) to-syv dage postvaccination, normal god landbrugspraksis udtryk af antigen-normal god landbrugspraksis fusion protein er visualiseret med et fluorescens mikroskop. (5) fluorescerende del af ryggens muskler kan dissekeret og anvendes til protein udvinding. Størrelsen af fusion protein er bekræftet med en western blot analyse og udtryk niveau med normal god landbrugspraksis-ELISA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: visualisere udtryk af antigen-EGFP fusion protein. Bedøvede voksen zebrafisk er vaccineret med 12 µg af eksperimentel vaccineantigener (antigen 1 – 3) og injektionsstedet er electroporated, efterfølgende, med seks 40 V, 50 ms pulser. To til syv dage postvaccination, injektionsstedet er afbildet med et mikroskop. For det første er udtryk for normal god landbrugspraksis registreret under et fluorescens mikroskop. Området er undersøgt ved hjælp af en 2 X størrelsen mål og afbildet og gemt i .tiff form. Lysmikroskop billede af det samme område er fusioneret med fluorescens billedet ved hjælp af ImageJ software. Antal og placering af antigen udtryk kan variere mellem antigener og enkelte fisk. For eksempel udtryk for antigen 1 er observeret på tværs af den dorsale muskel og udtryk for antigen 2 ses som små pletter, der henviser til, at antigen 3 er stærkt udtrykt i et mere begrænset område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: teste effektiviteten af vaccine kandidater mod en mykobakterielle infektioner. (1) voksen zebrafisk er vaccineret med eksperimentelle DNA-vacciner mod mycobacteriosis. (2) fem uger postvaccination, fisk er inficeret med en lav dosis af Mycobacterium marinum (~ 30 cfu). (3) fire uger senere, den indre organer er dissekeret og bruges til DNA-ekstraktion. (4) bakterietallet i hver fisk er kvantificeret med qPCR ved hjælp af M. marinum-specifikke primere. Vaccination med antigen 1 førte til et betydeligt fald i de bakterielle tæller (p < 0,01, to-vejs ANOVA), mens antigener 2 og 3 havde ingen effekt. (5) beskyttende effekt af de mest lovende vaccine kandidat (antigen 1) er yderligere evalueret i en overlevelse eksperiment, hvor fisk er inficeret med en høj dosis (~ 10.000 cfu) af bakterier og deres overlevelse er overvåges for 12 uger. Konsekvent med faldet i den bakterielle byrde observeret i panelet 4, vaccination med antigen 1 også forbedret overlevelse af fisk ved en M. marinum infektion (p < 0,01), tyder dette antigen kunne være en lovende kandidat til en ny vaccine mod tuberkulose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1: antal plasmid DNA påvirker plasmid-afledte EGFP udtryk i voksen zebrafisk. Grupper af fisk (n = 5 i hver gruppe) blev sprøjtet med 0,5 – 20 μg af pCMV-EGFP, og elektroporation (seks pulser af 50 V) blev brugt til at forbedre Transfektion. Kontrol fisk (CTRL) blev sprøjtet med 2 μg af Tom pCMV plasmid ikke indeholdende EGFP-genet. Normal god landbrugspraksis-ELISA var udført 3 dage postinjection til at definere den relative EGFP udtryk i fisk homogeniseret. P-værdier: *p < 0,03, **p < 0,004. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelser. NS = ikke betydelig. Dette tal er blevet tilpasset fra Oksanen35. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Proceduren for immuniserende voksen zebrafisk med DNA-baserede vacciner kræver nogle tekniske ekspertise. Selv for en erfaren forsker tager vaccinating en enkelt fisk ca 3 min, bortset fra præparater. Således kan et maksimum på omkring 100 fisk være vaccineret inden for en dag. Hvis mere end 100 fisk er nødvendige for eksperimentet, kan immuniseringer opdeles mellem op til 3 dage. Ud over kvaliteten af eksperimentet er tilstrækkelige uddannelsen af forsker for håndtering af fisk og udfører vaccination afgørende for trivsel af fisk. Sørg for at følge lokale juridiske og dyrevelfærdsmæssige regler og retningslinjer, når det kommer til bolig fisk, planlægger eksperimenterne, og de kvalifikationer, der kræves for det personale, der udfører forsøgene.
I sammendrag er der flere vigtige skridt til at undgå komplikationer i vaccination protokollen. For den vellykkede vaccination, sikrer at 1) fisk at blive immuniseret er sunde og tilstrækkelige i alder og størrelse (immunisering af mere ungfisk kan kræve ned-skalering vaccine volumen og indstillingerne for elektroporation); 2) fisk er korrekt bedøvede uden stærkere end 0,02% 3-aminobenzoic syre ethylester, og de forbliver bedøvede under hele proceduren (anæstesi skal holdes så kort som muligt for at sikre inddrivelse af fisken); 3) svampen pad er korrekt gennemblødt; 4) væske sprøjtes i hver puls fra pneumatisk pumpen, og hvis ikke, puls længden reguleres (trækker nålen lidt bagud langs y-aksen kan hjælpe); 5) der er ingen luftbobler med vaccine løsning; 6) elektroporation indstillinger og faktiske puls spænding og længden er korrekt; 7) elektroderne ikke forårsager hudskader på webstedet elektroporation (under elektroporation, holde elektroderne i blid kontakt med fisk, og frigive fisk straks ind i recovery tanken efter elektroporation).
Det er vigtigt at overvåge fisken efter elektroporation i recovery tank og aflive en fisk, der udviser tegn på ubehag. Derudover er det nødvendigt at øve proceduren før du starter en storstilet eksperiment, for at sikre en flydende arbejdsgang. Hvis det er muligt, anmode en tilstrækkeligt uddannede kollega om bistand med påfyldning nåle og elektroporation.
DNA vaccination metode gør det muligt for de skræddersyede design af vaccineantigener. Det er muligt at klone den hele antigen eller, helst, vælge dele af antigenet baseret på cellulære lokalisering og immunogenicitet24. Metoden kan desuden kombinere flere antigener eller adjuvanter i en vaccine konstruere eller indsprøjte flere separate plasmider på samme tid2. Ved herunder en stop codon efter antigen sekvens eller udtagelse EGFP genet fra plasmidet, er det muligt at udnytte den samme plasmid vektor også at udtrykke antigen uden efterfølgende N-terminale normal god landbrugspraksis. Dette kan rimelighed i bekræfter positive screening resultaterne, som de relativt store størrelse af normal god landbrugspraksis kan påvirke foldning af antigenet og således begrænse humorale svar potentielt fremkaldt af vaccination.
En højere antigen udtryk har været knyttet til DNA-vaccine immunogenicitet2. Elektroporation efter injektion, således medtaget i denne protokol, som det har vist sig at øge udtryk af antigener eller reporter gener fra firedoblet til tifold i zebrafisk32. Derudover forårsager elektroporation som en teknik, der moderat vævsskade, således inducerende lokale betændelse, der yderligere fremmer vaccine-induceret immunrespons2. På den anden side er elektroporation generelt veltolereret. Med det udstyr, der anvendes her, vil næsten 100% af voksne zebrafisk komme godt fra seks pulser af 40 V brugt i denne protokol35.
Ud over at bruge elektroporation til at forbedre optagelsen af vaccine plasmid ind i cellerne, bruger vi en stærk allestedsnærværende promotor i vaccine plasmid og en polyA hale i 3'-slutningen af antigenet for at forbedre antigen udtryk i transfekteret fisk celler. I nogle tilfælde, hvis codon skik sygdomsbærer mål væsentligt afviger fra de vaccinerede arter, er codon optimering blevet fundet nyttige i yderligere øge målet gen expression2. I denne zebrafisk -M. marinum model, men codon optimering havde ingen signifikant effekt på udtryk niveauer af to mykobakterielle model gener, ESAT-6 og den fælles fiskeripolitik-10, og dermed har, blevet anset for unødvendigt i denne model35 .
Target gen expression profiler har nogle tidsmæssige variation mellem antigener, afhængigt af, for eksempel på størrelse og struktur af de pågældende antigener. Antigen udtryk er dog normalt lignende inden for en gruppe af fisk immuniseret med den samme vaccine. Typisk, den klogeste EGFP udtryk er observeret fire dage til en uge postvaccination, men en skala fra 2-10 dage er muligt. Det anbefales at validere udtryk for hver antigen-EGFP fusion protein i en lille gruppe af fisk (2 – 3) før herunder antigenet i et omfattende eksperiment. Hvis ingen normal god landbrugspraksis udtryk er observeret på ethvert punkt 2 – 10 dage efter immunisering, Sørg for, at 1) vaccination protokollen blev nøje fulgt. Altid har en gruppe af fisk immuniseret med tomme pCMV-EGFP plasmid som positiv kontrol og sørge for, at 2) antigen design og molekylær kloning blev udført korrekt (passende primer design; antigenet og EGFP tag er begge i samme læsning ramme og ingen mellemliggende stop kodon er inkluderet). I nogle tilfælde, på trods af den korrekte antigen design, ikke kan normal god landbrugspraksis påvises. Dette kan skyldes forkert folde eller hurtig fordeling af fusion protein. Under disse omstændigheder kan det være nødvendigt at redesigne antigenet.
I vacciner, der er brugt til immun opdrættede fisk, er den plasmid dosis anvendes typisk 1 µg eller mindre7,33,34. I zebrafisk, kan reporter gen expression også påvises efter mindst en 0,5 µg plasmid injektion efter elektroporation; relative mål genekspression øger dog med en større mængde af plasmidet pr. fisk (tillægs figur 1). I fisk sprøjtes med pCMV-EGFP reporter plasmid, førte en indsprøjtning med 5 – 20 µg af plasmid fire til otte gange højere EGFP niveauer i forhold til fisk injiceres med 0,5 µg. Derfor, for at sikre et højt nok mål genekspression, men har injektionsvolumener, der er lille nok (≤7 µL) at forebygge eventuelle overskydende vævsskader eller vaccine lækage, valgte vi at anvende 5 til 12 µg pr. fisk til de indledende screening. Ud over vaccine immunogenicitet, en høj nok mål genekspression er forpligtet til at registrere reporter gen expression med et fluorescens mikroskop og med vestlige skamplet, som er nødvendige til screening at bekræfte den korrekte i vivo Oversættelse af target-antigen. Dog lavere plasmid doser (0,5-1 µg) kan være nyttige for andre typer af eksperimentelle anvendelser.
Til sidst, kan denne protokol for immunisering af voksen zebrafisk med en DNA plasmid bruges til præklinisk afprøvning af nye vaccine kandidater mod forskellige bakteriel eller viral infektioner. Udtryk for vaccineantigen som en normal god landbrugspraksis-fusion protein giver mulighed for visualisering af en vellykket immunisering begivenhed og antigen udtryk. Vi anvender denne metode til præklinisk screening af nye vaccine antigen kandidater mod tuberkulose. For dette, vi inficere zebrafisk fem uger postvaccination og bestemme bakterielle tæller i hver fisk med qPCR20,24.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for medlemmer af gruppen eksperimentelle immunologi forskning, og især at Leena Mäkinen og Hannaleena Piippo, for alt arbejdet, de har gjort med at udvikle og optimere vaccination protokollen, og deres hjælp i egentlige eksperimenter ved hjælp af protokollen.
Dette arbejde blev støttet af Jane Jensen Aatos Erkon Säätiö (Jane og Aatos Erkko-fonden til M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Foundation; at M.R.), den konkurrencedygtige statslige forskning finansiering af området ekspert ansvar i Tampere Universitet Hospital (til M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tuberkulose Foundation; at M.R., H.M. og M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (finsk kulturfond; at H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finsk Anti-tuberkulose Foundation; til H.M.), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö og Laina Kivi-fonden til M.N.) og Tampere by Science Foundation (til M.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
References
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
- Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
- Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
- Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
- Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).
- Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
- Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
- Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
- Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
- Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
- Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
- Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).
- Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
- Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
- Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
- Matthews, M., Varga, Z. M.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H.
- McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
- Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
- Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).
