시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 Time-Correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 Thylakoid 단백질 복합물의 분리

Summary

여기 선물이 solubilized thylakoid 단지 네이티브 그린 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 프로토콜. 녹색 젤 밴드는 이후 여 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 특징 및 데이터 분석을 위한 기본 단계 제공 됩니다.

Abstract

광합성의 빛 반응 thylakoid 막에 안료 단백질 복합물의 시리즈에 의해 수행 됩니다. 산출할 및이 단지의 길고 짧은 시간 비늘 광합성 환경 조건 변화에 적응 하는 프로세스 때문에 매우 동적 이다 (즉, 비-광화학 냉각, 상태 전환 및 장기 응답)입니다. 역사적으로, 이러한 프로세스는 시선 변화 측면에서 설명 엽록소 형광 그리고 분광학 광합성 매개 변수를 모니터링 하는 중요 한 방법에 남아 있다. 제한 된 수의 기본 단백질 복잡 한 역학 구상 될 수 있는 방법 있다. 여기는 고해상도 분리 및 thylakoid 단지, 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법의 시각화를 위한 빠르고 간단한 방법에 설명합니다. 이 메서드는 시간 상관 단일 광자 밴드 녹색 젤에 분리의 엽록소 형광 특성의 상세한 묘사에 대 한 계산 된 결합 이다.

Introduction

광합성 생물 끊임없이 변화 하는 환경 조건 그들의 생산성을 극대화 하 고 이웃¹과 성공적으로 경쟁 하기 그들의 생리학을 조정 해야 합니다. 이 기계 주변광 조건 전체 햇빛과 그림자 사이 3 개의 크기 순서에 의해 변동 될 수 있습니다으로 광합성, 빛 반응에 대 한 책임의 특히 사실 이다. 또한, 가뭄, 감기, 또는 열 스트레스 같은 빛 반응의 제품에 대 한 자연 전자 싱크 탄소 고정을 위한 탄소가 산화물의 가용성을 줄일 수 있습니다. 식물 해야 합니다, 그리고 따라서 하 게 수확 하 고 필요에 따라 초과 빛 에너지를 발산 하는 능력을 유지 하면서 가능한 한 효율적으로 태양 복사를 활용. 반면 photooxidative 손상을 계속 발생 합니다 정기적으로 모든 조명 조건^2,3, 실패 관리를 흡수 여기 에너지 성공적으로 치명적인 세포 손상과 죽음으로 이어질 수 있습니다. 몇 가지 적응 메커니즘 통용 환경 조건에서 변화 하 고 일시적인 변동 (즉, 길고 짧은 timescales 이상)⁴튜닝할 광합성 장치를 허용 하는 존재. 장기 응답 (LTR) 및 비-광화학 냉각 (NPQ) 포함 됩니다. NPQ 상태 전환 (qT), 냉각 (qE 급속 하 게 유도할 수 있는 에너지), 및 photoinhibition (제나라)⁵를 포함 하 여 적어도 3 개의 다른 구성 요소 현상, 포괄 하는 것으로 간주 그 자체 이다.

이러한 프로세스를 관찰 원래 되었고 광 현상으로 크게 정의 [예를 들어, NPQ 참조 한 방울의 속도 증가 때문만 아니다 (엽록소 형광의 냉각) 관찰된 엽록소를 형광에 광화학]⁶. “상태 전환” 유사 하 게 관찰 하는 의미에서 PSI과 PSII⁷에서 형광의 상대적인 양을 변경 합니다. 이러한 현상의 열거형으로 가능 하 게 만든 분 광 기법을 동안 [특히, 펄스 진폭 변조 (PAM) 형광 분광학] 계속 관찰 하 고 광합성 프로세스 에서 해 부를 위한 중요 한 수단 vivo, 훌륭한 제의로 생화학의 이러한 분 광 관측을 기본 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 필요한입니다. 상태 전환, 예를 들어, STN7 키 니 아 제 및 TAP38/PPH1 인산 가수분해 효소, 각각^8,,910LHCII 단백질의 인 산화/dephosphorylation 주기를 포함 한다. 이 주기 조정 PSII에서 PSI, 그로 인하여 흡수 변화 LHCII trimers의 일부를 이동 하 여 두 개의 photosystems 사이 LHCII 안테나의 물리적 배포 photosystems^11,12의 횡단면. 빠르게에 NPQ의 qE 구성 요소 violaxanthin/제 아 잔 틴 epoxidation/드-epoxidation 사이클과 PsbS 단백질의 활동을 통해 열 과도 여기 에너지를 변환합니다. 이 과정에서 PsbS의 정확한 역할은 여전히 하지 완전히 이해¹³. Photoinhibition, NPQ의 키 구성 요소는 일반적으로 PSII의 D1 단백질에 손상을 관찰 작용. 전체 광합성 능력의 복원 손상 된 PSII photocenters를 해결 하기 위해 정교한 복구 프로세스가 필요 합니다. PSII 수리 주기 PSII 단지는 granal 스택, 단지 철거, 손상 된 D1 단백질의 보충, PSII 단지의 리어셈블리 및 granal 스택¹⁴에 다시 PSII 단지의 움직임의 마이그레이션이 포함 됩니다. Photoinhibition PSII photodamage의 정확한 특성 강렬한 감시¹⁵의 주제에 남아 있다.

현상 상태 처럼 공부에 어려움 전환 또는 PSII 수리 부분에 복잡 한 생화학 시스템의 역학을 시각화 하기 위해 하나의 간단한 방법 사실에서 발생 합니다. 프로세스를 이해 하 고전 생 화 확 적인 방법은 고립에서 특성화 될 수 있도록 먼저 구성 요소를 별도 것입니다. 기본 젤 전기 이동 법 성공적인 노력에서 분리 하 고 더 많은 대리점 메서드 (즉 자당 기온 변화도 원심 분리 크로마토그래피)¹⁶thylakoid 막에서 photosystem 단지 특성화는 1980 년대에서 일어났다. 세제 시스템 부드럽게 solubilize thylakoid 막에서 네이티브 복합물을 개발 했다 곧 적응 전기 이동 별거 방법, 가장 주목할만 하 게 알 렌과 Staehelin¹⁷ 과 베드로 Thornber¹⁸, 기한 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법. 동안 다양 한 기술 실험 무기고, 기본 페이지에서에서 대표 단 하나 광합성 연구에 널리 고용된 방법 만든 매력적인 특성의 수를 있다. 기본 페이지는 상대적으로 신속 하 고 간단, thylakoid 복합물의 많은 수의 고해상도 분리를 동시에 제공 하면서 약간 특수 장비가 필요. 이것은 네이티브 페이지 thylakoid 역학을 공부 하 고, 두 번째 차원 다양 한 세제 및 버퍼 시스템, 찾기 및 새로운 thylakoid 단지에 대 한 다양 한 시스템에 있는 표준 페이지와 함께 하는 편리한 도구.

즉, 네이티브 녹색 젤 했다 특히 경험이 손에, 신뢰할 수 없는 기술을 위한 명망 그것은 쉽게 퍼지, 더럽혀진 젤 몇 밴드와 함께 구성 된 가난한 결과 생산. 이 문제가 블루 기본 페이지¹⁹의 소개와 함께, 일부 해결 되었다. BN 버퍼 시스템에서 coommassie 염료를 사용 하 여 보다 강력한 단백질 분리를 합니다. 따라서, BN 페이지 종종 상대 초보자 설정에 대 한 쉽고 더 안정적인 기술 이며 단지 thylakoid 고해상도 분판을 제공할 수 있습니다. 이러한 이유로, BN-페이지는이 분야의 대부분의 작업에 대 한 선택의 방법 되었다. BN-페이지는 일반적으로 그것의 주요 결점은 녹색 젤 전기 이동 법, 보다 실행 속도가 느린 동시 다운스트림 희미 한 엽록소를 포함 밴드, 식별과 방해 coommassie 염료 얼룩이 광 특성화 문제입니다.

기본 젤에서 생 화 확 적인 정보 제공 그리고 분 광 기술에서 데이터와 함께 2D SDS 페이지 크게 강화 될 수 있다. 고용 시스템에 단지를 식별 하기 위해 기본 젤을 사용 하 여 중앙 문제는 식별 도전 수 있습니다 항상 (즉, 단백질 밴드에서 찾을 수 항상 대표 comigrating 단지 또는 구성 요소, 오히려 보다는 하나의 순수 정통 복잡). 분 광 특성 녹색 젤 밴드 안료에 대 한 생물 정보를 제공 하 고 확인할 어떤 유형의 단지 그들은 포함 하는 데 사용 수 있습니다. 엽록소 형광은 종종 극적으로 다른 스펙트럼 및 형광 수명 다른 광합성 안료 단백질 복합물의 특성 때문에 이런 맥락에서 특히 유용 합니다. 간단한 정상 77 K 형광 스펙트럼 네이티브 젤 단지의 정체성 확인에 유용한 있다 역사적으로, 현대 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 훨씬 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. TCSPC 형광 수명에 따라 단지의 특성 뿐만 아니라 수 있습니다 하지만 또한 가능 하 게 내는 스펙트럼 구성 요소 간의 에너지 전달의 자세한 설명. 특성의이 종류는 다양 한 기본 젤 시스템 확산의 사용으로 점점 더 필요 해지고 있다 그리고 새로운 상 상속 단지 발견 더 나은 인증 단백질 복합물의 식별을 허용 하 고 제공 하는 새로운 이 단지 작동 하는 방법에 대 한 생물 정보입니다.

이 문서에서 제공 하는 거의 또는 전혀 경험과 네이티브 젤 전기 이동 법의 빛 반응의 메커니즘을 조사 하기 위해 네이티브 thylakoid 단지의 높은 해상도 달성 하는 데 그 수는 방법 광합성입니다. 이 기본적인 기술은 다음 결과 개선 또는 다른 종에 적용을 확장 하는 실험의 재량에 증강 수 있습니다. 우리는 다음 TCSPC, 기본 분석 및 기술에 의해 제공 하는 데이터의 프레 젠 테이 션에 대 한 몇 가지 단계를 네이티브 녹색 젤 밴드를 쓰는 과정을 설명 합니다. TCSPC 분석 기본 젤 전기 이동 법의 커플링 인증 및 밴드 내에서 단백질 복합물의 생물 특성을 제공 하 여 이러한 젤 시스템의 유틸리티를 확장 합니다. 여기에 설명 된 녹색 젤 시스템 기반으로 개발한 알 렌과 Staehelin¹⁷ 일부 수정 하 고 슈왈츠 외에 사용 되는 동일 합니다. ²⁰.이 시스템은 많은 중 하나입니다 하지만이 방법론에 대 한 유용한 특정 기능. Thylakoid 절연, 젤 전기 이동 법, 및 TCSPC 분석 편리 하 게 수행할 수 있습니다 하루에 샘플 저장 및 저하의 잠재적인 문제를 만듦으로써 그것은 충분히 빠른. 우리는 또한이 메서드는 결과 우수, 최적화의 정도 따라 좋은 제공 하면서 미숙한 사용자의 손에서 강력한 찾을.

명심 하는 네이티브 젤에 시각 단지 조사 유 기체의 생물학에 뿐만 아니라 사용 하는 세제 및 버퍼 시스템에 중요 하다. 다른 세제와 버퍼 시스템 우선적으로 분리, 단지의 다른 종류 그리고 주어진된 광합성 유기 체는 모두는 어떤 주어진된 상황에서 있을 것입니다, 다른 유기 체에서 다른 단지 것입니다. 여기서 설명 하는 시스템은 슈왈츠 외에 설명 된 대로 PSI 고급의 연구에 특히 적합 합니다. ²⁰, 하지만 그것은 그 PSII 고급 공부에 대 한 스펙트럼의 더 불안정 끝에 떨어진다. Thylakoid 단백질의 네이티브 젤 전기 이동 법에 사용 되는 다양 한 세제 및 버퍼 시스템의 포괄적인 연구를 위해 Järvi 외를 검토 하는 것이 좋습니다. ²¹ 그리고 Rantala 외. ²².

Protocol

1. 재고 솔루션 준비 네이티브 녹색 젤 쏟아져 40% 글리세롤, 200mm 글리신, 및 100 mM Tris pH 8.3에 버퍼의 구성 된 젤을 해결 하기 위한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다. 겹쳐 쌓이는 젤 40% 글리세롤, 200mm 글리신, 100 mM Tris 버퍼 pH 6.3에 구성 된에 대 한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다. 금형의 성장을 방지 하기 위해 4 ° C에서이 버퍼를 저장 합니다.참고: 버퍼 되므로 ?…

Representative Results

녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 레인 1 시금치 thylakoids, 명확 하 고 날카로운 녹색 밴드의 최대 수를 볼 수 있습니다의 녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 이상적인 결과의 예를 제공 합니다. 이러한 결과 다소 불규칙 하 고, 일부 레인 1에서 본 밴드의 모든 정상적으로 주어진된 샘플에 존재 하기 때문에. 추가 샘플 정리,…

Discussion

성공적인 thylakoid 가용 화 및 실행 기본 젤 중요 한 왜곡 없이 젤에 여러 가지 표시 녹색 밴드의 해상도 또는 밴드의 번짐 발생 합니다. 젤 오버 로드, 높은 세제 농도, 잘못 된 샘플 pH으 소재, 젤 너무 빠르게 또는 너무 높은 온도에서 실행 되며 잘못 부 젤 제대로 해결된 thylakoid 단지에 기여할 수 있는 모든 요소. 젤 자체의 조건 최적화 하는 동안 (예., 아크릴 그라데이션 농도), 그것은 관심의…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333