Adskillelse af spinat tylakoid proteinkomplekser af indfødte grøn gelelektroforese og Band karakterisering ved hjælp af Time-Correlated enkelt foton tælle

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at adskille solubilized tylakoid komplekser af indfødte grøn Gel elektroforese. Grøn gel bands karakteriseres efterfølgende af tid korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) og grundlæggende trin til dataanalyse leveres.

Abstract

Lys reaktioner af fotosyntesen er udført af en serie af pigmenterede proteinkomplekser i tylakoid membraner. Støkiometrisk og organisation af disse komplekser er yderst dynamisk på både lang og kort tidsskalaer på grund af processer, der tilpasser fotosyntese skiftende miljøforhold (dvs. ikke-fotokemisk quenching, statens overgange, og de langsigtede svar). Historisk set har disse processer har været beskrevet hjælp i form af ændringer i klorofyl fluorescens, og spektroskopi er fortsat en vigtig metode for fotosyntetiske overvågningsparametre. Der er et begrænset antal måder den underliggende protein komplekse dynamik kan visualiseres. Her beskriver vi en hurtig og enkel metode til høj opløsning adskillelse og visualisering af tylakoid komplekser, native grøn gelelektroforese. Denne metode er kombineret med tid-korreleret enkelt foton optælling for detaljerede karakterisering af klorofyl fluorescens egenskaber af bands adskilt på den grønne gel.

Introduction

Fotosyntetiske organismer skal hele tiden tilpasse deres fysiologi skiftende miljøforhold kan maksimere deres produktivitet og med held konkurrere med naboer¹. Dette er især tilfældet for maskinen ansvarlig for lys reaktioner af fotosyntesen, som omgivende lys betingelser kan svinge af tre størrelsesordener mellem skygger og fuld sollys. Derudover kan miljømæssige faktorer såsom tørke, kulde eller varmestress reducere tilgængeligheden af kuldioxid til kulstof fiksation, som er naturlige elektron vasken for produkter af lys reaktioner. Planter skal derfor høst og udnytte solens stråler så effektivt som muligt samtidig bevare evnen til at bortlede overskydende lys energi som nødvendigt. Mens photooxidative skader opstår stadig rutinemæssigt under alle lysforhold^2,3, manglende evne til at administrere absorberes excitation energi med succes kan føre til katastrofale celleskader og død. Flere adaptive mekanismer eksisterer der tillader fotosyntetiske apparatet til at blive tunet både ændringer i fremherskende miljøforhold og forbigående udsving (dvs. over både lange og korte tidshorisonter)⁴. Disse omfatter langsigtede svar (LTR) og ikke-fotokemisk dæmper (NPQ). NPQ er i sig selv anses for at omfatte mindst tre andre komponent fænomener, herunder statens overgange (qT), hurtigt inducerbar energi quenching (qE) og photoinhibition (qI)⁵.

Disse processer var oprindeligt observeret og defineret i vid udstrækning i forhold til spektroskopiske fænomener [fx NPQ refererer til et fald i observerede klorofyl fluorescens (quenching af klorofyl fluorescens), ikke der skyldes en stigning i antallet af fotokemi]⁶. Udtrykket “statens overgange” ligeledes henviser til de observerede ændringer i den relative mængde af fluorescens fra PSI og PSII⁷. Mens de spektroskopiske teknikker, der har muliggjort opregning af disse fænomener [bl.a puls amplitude moduleret (PAM) Fluorescens spektroskopi] og fortsat være et vigtigt middel til at observere og dissekere fotosyntetiske processer i vivo, en hel del af biokemi er forpligtet til at belyse mekanismerne bag disse spektroskopiske observationer. Statens overgange, indebærer for eksempel en fosforylering/dephosphorylation cyklus af LHCII proteiner af STN7 kinase og TAP38/PPH1 fosfatase, henholdsvis^8,9,10. Denne cyklus justerer den fysiske distribution af LHCII antenne mellem de to bannersystem ved at flytte en del af LHCII trimere fra PSII til PSI, dermed ændre absorptionen tværsnit af bannersystem^11,12. QE komponent af NPQ omdanner hurtigt overskydende excitation energi til varme gennem handlinger violaxanthin/zeaxanthin epoxidation/de-epoxidation cyklus og PsbS protein. PsbS nøjagtige rolle i denne proces er endnu ikke fuldt forstået¹³. Komponenten qI, NPQ, photoinhibition, er generelt tilskrives for at beskadige til D1 protein af PSII. Restaurering af fuld fotosyntetiske kompetence kræver en omfattende reparation at fastsætte beskadigede PSII photocenters. PSII reparation cyklus indebærer overførsel af PSII komplekser ud af granal stakke, afvikling af komplekser, udskiftning af beskadigede D1 proteiner, gensamling af PSII komplekser, og flytningen af PSII komplekser tilbage til granal stakke¹⁴. Den nøjagtige karakter af photoinhibition og PSII solskader er fortsat genstand for intens¹⁵.

Vanskeligheden ved at studere fænomener som stat overgange eller PSII reparation skyldes delvis, at der er ikke en enkel måde at visualisere mekanikken i komplekse biokemiske systemer. Den klassiske biokemiske tilgang til at forstå en proces er at først separate dens komponenter, således at de kan karakteriseres i isolation. Native gelelektroforese opstod fra vellykkede indsats i 1980 ‘ erne til at adskille og karakterisere photosystem komplekser fra tylakoid membraner med flere forberedende metoder (nemlig saccharose gradient centrifugering og kromatografi)¹⁶. De detergent systemer udviklet til at forsigtigt solubilize de indfødte komplekser fra tylakoid membraner blev snart tilpasset til elektroforetisk adskillelse metoder, især af Allen og Staehelin¹⁷ og og Peter og Thornber¹⁸, giver anledning native grøn gel elektroforese. Mens der repræsenterer kun én ud af en række forskellige teknikker i den eksperimentelle arsenal, native side har en række attraktive egenskaber, der har gjort det enmetode bredt ansat i fotosyntesen forskning. Native side er forholdsvis hurtig og enkel, der kræver lidt specialiseret udstyr, mens det giver høj opløsning adskillelse af et stort antal tylakoid komplekser samtidigt. Dette gør indfødte side et praktisk værktøj til at studere tylakoid dynamics og, når kombineret med standard side i den anden dimension samt en bred vifte af vaskemiddel og buffer systemer, en alsidig system til at finde og karakterisere nye tylakoid komplekser.

Når det er sagt, har native grønne geler haft et ry for at være en upålidelig teknik, især i uerfaren hænder, da det er let at producere dårlige resultater bestående af fuzzy, smeary geler med få bands. Dette problem blev løst, delvis med indførelsen af blå-native side¹⁹. Brugen af coommassie farvestof i BN buffersystem gør protein adskillelse mere robust. Derfor, BN-side er ofte en nemmere og mere pålidelig teknik til en relativ novice til at konfigurere og kan levere høj opløsning separationer af tylakoid komplekser. Af disse grunde, er BN-side blevet den foretrukne metode for de fleste arbejde i dette felt. Mens BN-side er generelt langsommere at køre end grøn gelelektroforese, dens største ulempe er, at coommassie farvestof farvning forstyrrer identifikation af svage klorofyl-holdige bands, mens også gør downstream spektroskopiske karakterisering problematisk.

De biokemiske oplysninger leveret af indfødte geler og 2D SDS-PAGE kan styrkes kraftigt, når kombineret med data fra spektroskopiske teknikker. Et centralt problem med ved hjælp af indfødte gels til at identificere komplekser er uanset systemet ansat, at identifikationen kan altid blive udfordret (dvs. proteinerne, der findes i et band kunne altid repræsenterer comigrating komplekser eller komponenter, snarere end et enkelt fysiologisk autentiske kompleks). Spektroskopiske karakterisering trinvis pigmenter i grøn gel bands biofysiske og kan bruges til at afgøre, hvilke typer af komplekser de er tilbøjelige til at indeholde. Klorofyl Fluorescens er især nyttige i denne henseende på grund af den ofte dramatisk forskellige spektre og fluorescens levetid, der er karakteristiske for forskellige fotosyntetiske pigment-protein komplekser. Mens enkle steady-state 77K fluorescens-spektre har historisk set været nyttigt i bekræfter identiteten af indfødte gel komplekser, kan moderne tid-korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) give meget mere information. TCSPC giver ikke kun en karakterisering af komplekser baseret på fluorescens levetid, men også gør muligt en detaljeret beskrivelse af energioverførsel mellem spektrale komponenter inden for et kompleks. Denne form for karakterisering stadig mere nødvendigt som brugen af forskellige indfødte gel systemer spreads og nye formodede komplekser er opdaget, identifikation af proteinkomplekser godkendes bedre og giver nye biofysiske oplysninger om, hvordan disse komplekser arbejde.

I dette papir, vi leverer en metode, der gør det muligt for dem, der har lidt eller ingen erfaring med indfødte gelelektroforese at opnå høj kvalitet opløsning af indfødte tylakoid komplekser med henblik på at undersøge mekanikken i lys reaktioner fotosyntese. Denne grundlæggende teknik kan derefter blive udvidet til den eksperimentatoren at forbedre resultaterne eller udvide anvendeligheden til andre arter. Vi beskriver derefter processen for underkaste indfødte grøn gel bands til TCSPC, samt nogle trin til grundlæggende analyse og præsentation af oplysningerne fra teknikken. Kobling af indfødte gelelektroforese med TCSPC analyse udvider nytten af disse gel-systemer ved at give godkendelse og Biofysisk karakterisering af proteinkomplekser bands fra. Grøn gel system beskrevet her er baseret på at udviklet af Allen og Staehelin¹⁷ med nogle ændringer og er den samme som bruges i Schwarz mfl. ²⁰. dette system er en af mange, men har særlige funktioner, der er nyttige for denne metode. Det er hurtig nok så tylakoid isolation, gelelektroforese og TCSPC analyse praktisk kan udføres på én dag, hos potentielle problemer med opbevaring af prøven og nedbrydning. Vi finder også, at denne metode er robust i hænderne på uerfarne brugere, mens det stadig giver resultater der spænder fra gode til overlegen, afhængigt af graden af optimering.

Det er vigtigt at huske på, komplekser visualiseret på en indfødt gel afhænger på både vaskemiddel og buffer systemer anvendes og biologi af organisme under undersøgelsen. Forskellige vaskemiddel og buffer systemer adskille fortrinsvis forskellige slags komplekser, og en given fotosyntetiske organismer vil have forskellige komplekser fra andre organismer, ikke alle vil være til stede under de givne omstændigheder. Systemet beskrevet her er særlig velegnet til undersøgelse af PSI megacomplexes, som beskrevet i Schwarz mfl. ²⁰, men det falder på den mere destabiliserende ende af spektret for dem studerer PSII megacomplexes. For en omfattende undersøgelse af de forskellige vaskemiddel og buffer systemer anvendes i native gelelektroforese af proteiner, tylakoid, anbefales det at gennemgå Järvi mfl. ²¹ og Rantala et al. ²².

Protocol

1. stamopløsninger forberedelse til hælde indfødte grønne geler Forberede en 4 x koncentreret bufferopløsning til at løse geler bestående af 40% glycerol, 200 mM glycin og 100 mM Tris buffer til pH 8.3. Forberede en 4 x koncentreret bufferopløsning til stabling geler bestående af 40% glycerol, 200 mM glycin og 100 mM Tris buffer til pH 6.3. Gemme disse buffere ved 4 ° C til at forhindre vækst af skimmel.Bemærk: Bufferne er stabil i måneder ved 4 ° C, så forberedelsen af 10…

Representative Results

Repræsentative resultater for grøn gelelektroforese er præsenteret i figur 1. Lane 1 giver et eksempel på ideelle resultater for grøn gelelektroforese af spinat tylakoiderne, hvor et maksimalt antal klare, skarpe grønne bands er synlige. Disse resultater er lidt atypisk, delvis fordi ikke alle bands set i lane 1 er normalt findes i en given prøve. Ekstra prøve oprydning, i form af grønkorn isolation før tylakoid oploesning og gradient gelelektrofore…

Discussion

En vellykket tylakoid oploesning og indfødte gel køre vil resultere i løsningen af flere forskellige synlige grønne bands på gel uden betydelige fordrejninger eller udtværing af bandene. Overbelastning gel, en høj vaskemiddel koncentration, en forkert prøve pH, uopløst materiale, kører gel for hurtigt eller for høj temperatur, og en forkert hældte gel er alle faktorer, der kan bidrage til dårligt løst tylakoid komplekser. Samtidig med at optimere betingelserne for gel, sig selv (fx., acrylamid grad…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333