Trennung von Spinat Thylakoidmembran Proteinkomplexe durch Native grün Gelelektrophorese und Band Charakterisierung mittels Time-Correlated Single Photon Counting

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur solubilisiert Thylakoidmembran komplexe durch Native grün Gelelektrophorese getrennt. Grüne Gel Bänder zeichnen sich danach durch Zeit korreliert Single Photon Counting (TCSPC) und grundlegenden Schritte für die Datenanalyse werden zur Verfügung gestellt.

Abstract

Die Licht-Reaktionen der Photosynthese werden durch eine Reihe von pigmentierten Proteinkomplexe in die Thylakoidmembran Membranen durchgeführt. Die Stöchiometrie und Organisation dieser komplexe ist sehr dynamisch an langen und kurzen Zeitskalen durch Prozesse, die Photosynthese an sich verändernde Umweltbedingungen anpassen (d.h. nicht-photochemische abschrecken, Statusübergänge, und die langfristige Antwort). In der Vergangenheit diese Prozesse haben spektroskopisch im Hinblick auf Veränderungen im Chlorophyllfluoreszenz beschrieben, und Spektroskopie bleibt eine wichtige Methode zur Überwachung der photosynthetischen Parameter. Es gibt eine begrenzte Anzahl von Möglichkeiten, in denen die zugrunde liegenden komplexen Proteindynamik visualisiert werden können. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode für die hochauflösende Trennung und Visualisierung der Thylakoidmembran komplexe, native grüne Gelelektrophorese. Diese Methode ist gekoppelt mit Zeit korreliert einzelnes Photon counting für detaillierte Charakterisierung der Chlorophyll-Fluoreszenzeigenschaften von Bands, die auf das grüne Gel getrennt.

Introduction

Photosynthetische Organismen müssen ständig ihre Physiologie an sich verändernde Umweltbedingungen zu maximieren Sie ihre Produktivität und erfolgreich konkurrieren mit Nachbarn¹anpassen. Dies gilt insbesondere für die Maschinen verantwortlich für die Licht-Reaktionen der Photosynthese als Umgebungslicht, die Bedingungen um drei Größenordnungen zwischen Schatten und volle Sonne schwanken können. Umweltfaktoren wie Trockenheit, Kälte oder Hitze-Stress können darüber hinaus die Verfügbarkeit von Kohlendioxid für die Kohlenstoffspeicherung, verringern, die das natürliche Elektron für die Produkte der Licht-Reaktionen Waschbecken. Pflanzen müssen deshalb ernten und Sonnenstrahlung möglichst effizient zu nutzen, unter Beibehaltung der Fähigkeit, überschüssige Lichtenergie wie nötig zu zerstreuen. Während photooxidativen Schäden weiterhin routinemäßig unter allen Lichtverhältnissen^2,3, Fehler zu verwalten aufgenommene Anregungsenergie erfolgreich zu den katastrophalen Zellschäden und zum Tod führen kann auftritt. Verschiedene Anpassungsmechanismen vorhanden, mit die der photosynthetischen Apparat zu Veränderungen der vorherrschenden Umweltbedingungen und vorübergehende Schwankungen (z.B. über lange und kurze Fristen)⁴abgestimmt werden können. Dazu gehören die langfristige Reaktion (LTR) und nicht-photochemische abschrecken (NPQ). NPQ ist selbst als umfassen mindestens drei andere Komponente-Phänomene, einschließlich Statusübergänge (qT), schnell induzierbaren Energie abschrecken (qE) und Photoinhibition (qI)⁵.

Diese Prozesse wurden ursprünglich beobachtet und vor allem in Bezug auf die spektroskopische Phänomene definiert [z. B. NPQ bezieht sich auf einen Tropfen im beobachteten Chlorophyll-Fluoreszenz (abschrecken der Chlorophyll-Fluoreszenz), die nicht durch einen Anstieg der Rate von Photochemie]⁶. Bezeichnet der Begriff “Statusübergänge” ähnlich der beobachteten Veränderungen in der relativen Höhe der Fluoreszenz von PSI und PSII⁷. Während die spektroskopischen Techniken, die Aufzählung dieser Phänomene möglich gemacht haben [insbesondere Puls Amplitude moduliert (PAM) Fluoreszenz-Spektroskopie] und weiterhin ein wichtiges Mittel zur Beobachtung und Zergliederung photosynthetische Prozesse in Vivo, viel der Biochemie ist erforderlich, um die Mechanismen, die diese spektroskopischen Beobachtungen zu erhellen. Staatliche Übergänge zum Beispiel beinhaltet einen Phosphorylierung/Dephosphorylation-Zyklus der LHCII Proteine durch die STN7-Kinase und TAP38/PPH1 Phosphatase, jeweils^8,9,10. Dieser Zyklus stellt die physische Verteilung der LHCII Antenne zwischen die beiden Photosysteme indem Sie einen Teil des LHCII Trimere von PSII auf PSI, verändert dadurch die Absorption Querschnitt der Photosysteme^11,12. Die qE-Komponente des NPQ wandelt schnell überschüssige Anregungsenergie in Wärme durch die Aktionen des Violaxanthin/Zeaxanthin Epoxidierung/de-Epoxidierung Zyklus und die PsbS Protein. Die genaue Rolle des PsbS in diesem Prozess ist noch nicht vollständig verstanden,¹³. Die qI-Komponente von NPQ, Photoinhibition, wird im allgemeinen zugeschrieben, um Schäden an der D1-Protein des PSII. Wiederherstellung der vollen photosynthetischen Kompetenz erfordert einen aufwendige Reparatur-Prozess, beschädigte PSII Photocenters zu beheben. Die PSII Reparatur-Zyklus umfasst die Migration der PSII komplexe granal Stapel, Abbau der Anlagen, Ersatz der beschädigten D1 Proteine, Zusammenbau der PSII komplexe und Bewegung von PSII komplexe zurück in die granal Stapel¹⁴. Die genaue Art des Photoinhibition und PSII lichtbedingten bleibt ein Thema der intensiven Kontrolle¹⁵.

Die Schwierigkeit bei der Untersuchung von Phänomenen wie Zustand übergeht oder PSII Reparatur ergibt sich teilweise aus der Tatsache, dass es nicht eine einfache Möglichkeit, die Mechanik des komplexen biochemischen Systemen zu visualisieren. Der klassische biochemische Ansatz zum Verständnis eines Prozesses ist, zunächst seine Bestandteile zu trennen, so dass sie isoliert charakterisiert werden können. Gebürtige Gelelektrophorese entstand aus der erfolgreichen Bemühungen in den 1980er Jahren zu trennen und zu charakterisieren das Photosystem komplexe aus der Thylakoidmembran Membranen mit mehr präparativen Methoden (nämlich Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung und Chromatographie)¹⁶. Die Waschmittel Systeme entwickelt, um sanft die native komplexe aus der Thylakoidmembran Membranen lösen wurden bald elektrophoretischen Trennmethoden, vor allem von Allen und Staehelin¹⁷ angepasst und und Peter und Thornber¹⁸, verursachend zur nativen grünen Gelelektrophorese. Während vertritt nur eine aus einer Vielzahl von Techniken in der experimentellen Arsenal, native Seite eine Reihe von attraktiven Eigenschaften, die es am meisten eingesetzten Methode in der Fotosynthese Forschung haben hat. Native Seite ist relativ schnell und einfach, erfordert wenig Spezialausrüstung, während gleichzeitig hochauflösende Trennung einer großen Anzahl der Thylakoidmembran komplexe. Dies macht native Seite ein praktisches Werkzeug für das Studium der Thylakoidmembran Dynamik und, in Kombination mit standard-Seite in der zweiten Dimension, sowie eine Vielzahl von Waschmittel und Puffer-Systeme, ein vielseitiges System für die Suche und Charakterisierung von neuen Thylakoidmembran komplexe.

Abgesehen davon hatten native grün Gele ein Renommee für sein eine unzuverlässige Technik, vor allem in unerfahrenen Händen, da es einfach ist, bestehend aus fuzzy, schmierig Gele mit wenigen Bands zu schlechten Ergebnissen. Dieses Problem wurde gelöst, unter anderem mit der Einführung des blau-Native Seite¹⁹. Die Verwendung von Coommassie Farbstoff in der BN-Puffersystem macht Protein Trennung robuster. Daher, BN-Seite ist oft ein einfacher und zuverlässiger Technik für ein relativer Neuling einzurichten und bieten hochauflösende Trennungen der Thylakoidmembran komplexe. Aus diesen Gründen ist die BN-Seite die Methode der Wahl für die meisten Arbeiten dieses Feldes geworden. Während BN-Seite in der Regel langsamer ist zu laufen als grüne Gelelektrophorese sein Hauptnachteil ist, dass die Coommassie Farbstoff Färbung mischt sich mit der Identifizierung von schwachen Chlorophyll-haltigen Bands, während auch nachgeschaltete spektroskopische die Charakterisierung ist problematisch.

Die biochemische Informationen bereitgestellt durch native Gele und 2D SDS-PAGE kann erheblich gestärkt werden, wenn Sie mit Daten aus spektroskopischen Techniken kombiniert. Unabhängig von dem System beschäftigt, ist ein zentrales Problem bei der Verwendung von nativen Gele, um komplexe zu identifizieren, dass die Identifizierung immer angefochten werden kann (d. h. die Proteine in einer Band gefunden konnte immer dar comigrating Anlagen oder Komponenten, eher als einen einzigen physiologisch authentische Komplex). Spektroskopische Charakterisierung biophysikalische informiert über die Pigmente in grüne Gel-Bands und kann verwendet werden, um festzustellen, welche Arten von komplexen sie voraussichtlich enthalten sind. Chlorophyll-Fluoreszenz ist besonders hilfreich in dieser Hinsicht aufgrund der oft dramatisch unterschiedliche Spektren und Fluoreszenz-Lebensdauer, die charakteristisch für verschiedene photosynthetische Pigmente-Protein-komplexe. Während einfache stationäre 77K Fluoreszenz Spektren historisch bestätigt die Identität der native Gel komplexe nützlich gewesen, kann moderne Zeit korreliert einzelnes Photon counting (TCSPC) viel mehr Informationen liefern. TCSPC ermöglicht nicht nur die Charakterisierung der Fluoreszenz-Lebensdauer-komplexe, sondern ermöglicht auch die detaillierte Beschreibung der Energieübertragung zwischen den spektralen Komponenten innerhalb eines Komplexes. Diese Art von Charakterisierung wird zunehmend notwendig, da die Verwendung von verschiedenen einheimischen Gel Systeme breitet sich immer und neuen vermeintlichen komplexe entdeckt werden, die Identifizierung von Proteinkomplexen besser authentifiziert werden und neu biophysikalische Informationen darüber, wie diese komplexe arbeiten.

In diesem Papier stellen wir eine Methode, die diejenigen, die wenig oder keine Erfahrung mit native Gelelektrophorese qualitativ hochwertige Auflösung von nativen Thylakoidmembran komplexe zum Zwecke der Untersuchung der Mechanik der Licht Reaktionen erreicht ermöglicht Photosynthese. Diese Grundtechnik kann dann der Experimentator Ermessen Ergebnisse verbessern oder erweitern Anwendbarkeit auf andere Arten erweitert werden. Wir beschreiben den Prozess für native grüne Gel Bands TCSPC, sowie einige Schritte für die grundlegende Analyse und Darstellung der Daten zur Verfügung gestellt durch die Technik zu unterwerfen. Die Kopplung der gebürtige Gelelektrophorese mit TCSPC Analyse erstreckt sich das Dienstprogramm dieser Gel-Systeme durch Authentifizierung und biophysikalischen Charakterisierung der Proteinkomplexe innerhalb der Bänder. Das grüne Gel System hier beschriebenen basiert auf, die von Allen und Staehelin¹⁷ mit einigen Modifikationen entwickelt und ist identisch mit dem in Schwarz Et al.verwendet. ²⁰. dieses System ist eine von vielen aber hat spezifische Eigenschaften, die nützlich für diese Methode sind. Es ist schnell genug, so dass Thylakoidmembran Isolation, Gelelektrophorese und TCSPC Analyse bequem an einem Tag erfolgen können, mögliche Probleme der Probe Lagerung und Abbau vermieden. Wir finden auch, dass diese Methode in die Hände von unerfahrenen Benutzern, robust und trotzdem einen Ergebnisse, die von Vorgesetzten, je nach dem Grad der Optimierung gut reichen.

Es ist wichtig zu bedenken, die die komplexe visualisiert auf eine native Gel abhängen auf das Waschmittel und Puffer Systemen verwendet, sowie über die Biologie des Organismus untersucht. Verschiedene Reinigungsmittel und Puffer-Systeme bevorzugt verschiedene Arten von komplexen trennen und haben ein bestimmter photosynthetische Organismus verschiedene komplexen von anderen Organismen, von denen nicht, die alle angegebenen keinesfalls anwesend sein wird. Das hier beschriebene System eignet sich besonders für die Untersuchung von PSI Megacomplexes, wie in Schwarz Et al.beschrieben. ²⁰, aber es fällt auf mehr destabilisierenden Ende des Spektrums für Studierende PSII Megacomplexes. Für eine umfassende Studie über die verschiedenen Reinigungsmittel und Puffer-Systeme in der gebürtige Gelelektrophorese der Thylakoidmembran Proteine verwendet empfiehlt es sich, Järvi Et al.zu überprüfen. ²¹ und Rantala Et al. ²².

Protocol

(1) auf lagerlösungen Vorbereitung für Native grün Gele gießen Bereiten Sie einem 4-fach konzentrierten Pufferlösung zur Beilegung von Gelen, bestehend aus 40 % Glycerin, 200 mM Glycin und 100 mM Tris, pH 8,3 gepuffert. Stacking Gele bestehend aus 40 % Glycerin, 200 mM Glycin und 100 mM Tris gepuffert, pH-Wert von 6,3 bereiten Sie einem 4-fach konzentrierten Pufferlösung vor. Speichern Sie diese Puffer bei 4 ° C das Wachstum von Schimmel zu verhindern.Hinweis: Die Puffer sind stab…

Representative Results

Repräsentative Ergebnisse für grüne Gelelektrophorese sind in Abbildung 1dargestellt. Bahn 1 enthält ein Beispiel für optimale Ergebnisse für grüne Gelelektrophorese von Spinat Thylakoids, in denen eine maximale Anzahl an klare, gestochen scharfe grüne Bänder sichtbar sind. Diese Ergebnisse sind teilweise etwas untypisch, weil nicht alle Bands gesehen in Spur 1 normalerweise in einer Probe vorhanden sind. Zusätzliche Probe Bereinigung, in Form von C…

Discussion

Eine erfolgreiche Thylakoidmembran Solubilisierung und native Gel laufen führt die Auflösung der mehrere deutliche sichtbare grüne Bänder auf dem Gel ohne signifikante Verzerrung oder Verschmieren der Bands. Überlasten das Gel, eine hohe Konzentration Waschmittel, eine falsche Beispiel pH-Wert, ungelösten Material, das Gel zu laufen, zu schnell oder bei zu hohen Temperaturen, und eine unsachgemäß gegossene Gel sind alle Faktoren, die zu schlecht gelöst Thylakoidmembran komplexe beitragen können. Bei gleichzeiti…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333