Separasjon av spinat Thylakoid Protein komplekser av innfødte Green Gel gelelektroforese og Band karakterisering ved hjelp Time-Correlated enkelt Foton teller

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å skille solubilized thylakoid komplekser av innfødte Green Gel geleelektroforese. Grunnleggende trinn for dataanalyse tilbys og grønne gel band er senere preget av tid korrelert enkelt Foton teller (TCSPC).

Abstract

Lys reaksjoner av fotosyntesen er utført av en rekke pigmentert protein kompleks i thylakoid membraner. Den støkiometri og organisering av disse kompleksene er svært dynamisk både lange og korte tidsskalaer grunnet prosesser som tilpasse fotosyntese på endrede miljøforhold (dvs. ikke-fotokjemisk slukke, staten overganger, og langsiktige svar). Historisk disse prosessene er beskrevet tyske i forhold til endringer i klorofyll fluorescens og spektroskopi er en viktig metode for å overvåke fotosynteseaktiviteten parametere. Det er et begrenset antall måter som underliggende protein kompleks dynamikken kan visualiseres. Her beskriver vi en rask og enkel metode for høyoppløselig separasjon og visualisering av thylakoid komplekser, innfødt grønne gel geleelektroforese. Denne metoden er kombinert med tid-korrelert enkelt Foton teller for detaljert karakterisering av klorofyll fluorescens egenskapene band atskilt på grønne gel.

Introduction

Fotosynteseaktiviteten organismer må justere fysiologi på endrede miljøforhold å maksimere produktiviteten og hell konkurrere med naboer¹. Dette er spesielt sant av maskiner som er ansvarlig for lys reaksjoner av fotosyntese, som omgivelseslys forhold kan variere med tre størrelsesordener mellom skygger og fullt sollys. I tillegg kan miljøfaktorer som tørke, kalde eller varmestress redusere tilgjengeligheten av kulldioksyd for karbon fiksering, som er naturlig elektron vasken for produkter av lys reaksjonene. Planter må, derfor høste og utnytte solstråling så effektivt som mulig samtidig beholde muligheten til å spre overflødig lys energi som nødvendig. Mens photooxidative skaden vedvarer rutinemessig under alle lysforhold^2,3, manglende evne til å administrere absorbert eksitasjon energi vellykket kan føre til katastrofale celleskader og død. Flere adaptive mekanismer eksisterer at fotosynteseaktiviteten apparatet stilles til endringer i rådende miljøforhold og forbigående svingninger (dvs. over både lange og korte tidsrammer)⁴. Disse inkluderer langsiktige svar (VTH) og ikke-fotokjemisk slukke (NPQ). NPQ er i seg selv anses å omfatte minst tre andre komponenten fenomener, inkludert staten overganger (qT), raskt induserbart energi slukke (qE) og photoinhibition (qI)⁵.

Disse prosessene var opprinnelig observert og definert i stor grad i spektroskopiske fenomener [f.eks NPQ refererer til et fall i observerte klorofyll fluorescens (slukke av klorofyll fluorescens) som ikke skyldes en økning i antall fotokjemi]⁶. Begrepet “staten overganger” tilsvarende refererer til observert endring i relative fluorescens PSI og PSII⁷. Mens spektroskopiske teknikker som har muliggjort opplisting av disse fenomenene [spesielt puls amplitude modulert (PAM) fluorescens spektroskopi] og fortsette å være en viktig metode for å observere og dissekere fotosynteseaktiviteten prosesser i vivo, mye av biokjemi er nødvendig for å belyse mekanismene bak disse spektroskopiske observasjoner. Staten overganger, for eksempel innebærer en fosforylering/dephosphorylation syklus av LHCII proteiner av STN7 kinase og TAP38/PPH1 fosfatase, henholdsvis^8,9,10. Denne syklusen justerer fysisk distribusjon av LHCII antennen mellom de to photosystems ved å flytte en del av LHCII trimers fra PSII til PSI, og dermed endre absorpsjon tverrsnitt av photosystems^11,12. QE komponenten NPQ konverterer raskt overflødig eksitasjon energi til varme gjennom handlingene til violaxanthin/zeaxanthin epoxidation/de-epoxidation syklusen og PsbS protein. Den eksakte rollen av PsbS i denne prosessen er ennå ikke fullt ut forstått¹³. QI komponenten av NPQ, photoinhibition, er vanligvis tilskrevet skader D1 protein av PSII. Restaurering av full fotosynteseaktiviteten kompetanse krever en forseggjort reparasjonsprosessen å reparere skadede PSII photocenters. PSII reparasjonssyklusen innebærer overføring av PSII komplekser av den granal stabler, demontering av komplekser, utskifting av skadet D1 proteiner, sammensetting av PSII komplekser og bevegelse av PSII komplekser tilbake i de granal stabler¹⁴. Det eksakte innholdet i photoinhibition og PSII photodamage er fortsatt gjenstand for intens granskning¹⁵.

Vanskeligheten i å studere fenomener som staten overganger eller PSII reparasjon oppstår delvis fra det faktum at det er ikke en enkel måte å visualisere mekanikken i komplekse biokjemiske systemer. Den klassiske biokjemiske tilnærmingen å forstå en prosess er å først skille komponentene slik at de kan karakteriseres isolert. Native gel geleelektroforese oppsto fra vellykkede innsats i 1980 å skille og karakterisere photosystem komplekser fra thylakoid membraner med flere skytevåpen metoder (sukrose gradient sentrifugering og kromatografi)¹⁶. Vaskemiddel systemer bebygget å forsiktig solubilize innfødte komplekser fra thylakoid membraner ble snart tilpasset electrophoretic separasjon metoder, spesielt ved Allen og Staehelin¹⁷ og og Peter og Thornber¹⁸, gir opphav Opprinnelig grønn gel geleelektroforese. Mens representerer bare én av en rekke teknikker i eksperimentell arsenal, Opprinnelig side har en rekke attraktive egenskaper som har gjort det mye næringsdrivende metode i fotosyntesen forskning. Opprinnelig side er relativt rask og enkel, krever lite spesialisert utstyr, samtidig som det gir høy oppløsning separasjon av et stort antall thylakoid komplekser samtidig. Dette gjør innfødt siden et praktisk verktøy for å studere thylakoid dynamics og, når kombinert med STANDARDSIDEN i den andre dimensjonen i tillegg til en rekke vaskemiddel og buffer systemer, en allsidig system for å finne og karakterisere nye thylakoid komplekser.

Som blir sagt, har innfødt grønne gels hatt et rykte for å være en upålitelig teknikk, spesielt i uerfarne hender, som det er lett å produsere dårlige resultater bestående av fuzzy, smeary gels med noen band. Dette problemet ble løst, delvis, med innføringen av blue-innfødt side¹⁹. Bruk coommassie fargestoff i BN bufferen systemet gjør proteiner mer robust. Derfor BN side er ofte en enklere og mer pålitelig teknikk for en relativ begynner å sette opp og gir høy oppløsning separasjoner av thylakoid komplekser. For disse grunner blitt BN-siden metoden for valg for de fleste i dette feltet. Mens BN-side er vanligvis tregere å kjøre enn grønne gel geleelektroforese, den største ulempen er at den coommassie fargestoffet flekker forstyrrer identifikasjon av svak klorofyll inneholder band, samtidig gjøre nedstrøms spektroskopiske karakterisering problematisk.

Biokjemiske informasjonen gitt av innfødte gels og 2D SDS-side kan være betydelig styrket kombinert med data fra spektroskopiske teknikker. Uavhengig av systemet, et sentralt problem med å bruke native gels for å identifisere komplekser er at identifikasjon kan alltid bli utfordret (dvs. proteinene som finnes i et band kan alltid representere comigrating komplekser eller komponenter, heller enn et enkelt fysiologisk autentisk kompleks). Spektroskopiske karakterisering gir Biofysiske informasjon om pigmenter i grønne gel band og kan brukes til å bestemme hvilke typer komplekser er sannsynlig å inneholde. Klorofyll fluorescens er spesielt nyttig i denne forbindelse på grunn av ofte dramatisk annerledes spectra og fluorescens levetid som er karakteristiske for annet fotosynteseaktiviteten pigment-protein komplekser. Mens enkel stabil 77K fluorescens spectra har historisk vært nyttig i å bekrefte identiteter av innfødt gel komplekser, kan moderne tid-korrelert enkelt Foton teller (TCSPC) gi mye mer informasjon. TCSPC tillater ikke bare karakterisering av komplekser basert på fluorescens levetid, men også gjør mulig den detaljerte beskrivelsen av energi-overføring mellom spectral komponenter i et kompleks. Denne typen karakterisering blir stadig nødvendig som bruk av ulike innfødt gel systemer oppslag og nye antatte komplekser er oppdaget, slik at identifikasjon av protein komplekser godkjennes bedre og gir nye Biofysiske informasjon om hvordan disse kompleksene fungerer.

Denne artikkelen gir vi en metode som gjør at de har liten eller ingen erfaring med innfødt gel geleelektroforese å oppnå høy kvalitet oppløsning av innfødte thylakoid komplekser for å undersøke mekanikken i lys reaksjoner av fotosyntese. Denne grunnleggende teknikken kan bli utvidet til eksperimentator forgodtbefinnende å forbedre resultatene eller utvide anvendelighet til andre arter. Vi beskriver prosessen med å utsette innfødt grønne gel band til TCSPC, samt noen trinn for grunnleggende analyse og presentasjon av dataene fra teknikken. Koblingen av innfødte gel geleelektroforese med TCSPC analyse utvider nytten av disse gel systemer ved hjelp av godkjenning og Biofysiske karakterisering av protein komplekser i bandene. Grønne gel systemet beskrevet her er basert på det utviklet av Allen og Staehelin¹⁷ med noen modifikasjoner og er den samme som brukes i Schwarz et al. ²⁰. dette systemet er en av mange, men har bestemte funksjoner som er nyttige for denne metoden. Det er rask nok slik at thylakoid isolasjon, gel geleelektroforese og TCSPC analyse praktisk kan utføres på en dag, obviating potensielle problemer med eksempel lagring og fornedrelse. Vi finner også at denne metoden er robust i hendene på uerfarne brukere, samtidig som den gir resultater som spenner fra god til overlegen, avhengig av graden av optimalisering.

Det er viktig å huske på at komplekser visualisert på en innfødt gel avhenger både vaskemiddel og buffer systemer brukes samt biologi av organismen under etterforskning. Forskjellige vaskemiddel og buffer systemer skille fortrinnsvis ulike typer komplekser, og en gitt fotosynteseaktiviteten organisme har forskjellige komplekser fra andre organismer, ikke alle som vil være tilstede under noen gitt omstendighet. Systemet er beskrevet her er spesielt egnet til studiet av PSI megacomplexes, som beskrevet i Schwarz et al. ²⁰, men det faller på mer destabiliserende enden av spekteret for de som studerer PSII megacomplexes. For en omfattende studie av ulike vaskemiddel og buffer i native gel geleelektroforese thylakoid proteiner, anbefales det å gjennomgå Järvi et al. ²¹ og Rantala et al. ²².

Protocol

1. lager løsninger forberedelse til helle innfødt grønne Gels Forberede en 4 x konsentrert buffer løsning for å løse gels som består av 40% glyserol, 200 mM glysin og 100 mM Tris bufret til pH 8.3. Forberede en 4 x konsentrert buffer løsning stabling gels som består av 40% glyserol, 200 mM glysin og 100 mM Tris bufret til pH 6.3. Lagre buffere på 4 ° C å hindre vekst av mold.Merk: Bufferne er stabile for måneder på 4 ° C, så utarbeidelse av 100-200 mL hver buffer for fort…

Representative Results

Representant resultater for grønne gel geleelektroforese presenteres i figur 1. Lane 1 gir et eksempel ideell resultater for grønne gel geleelektroforese av spinat thylakoids, der et maksimalt antall klare, skarpe grønn band er synlige. Disse resultatene er litt atypiske, delvis fordi ikke alle feltene i lane 1 er normalt finnes i et gitt utvalg. Flere eksempler opprydding, i form av chloroplast isolasjon før thylakoid solubilization og gradient gel gelee…

Discussion

En vellykket thylakoid solubilization og innfødt gel kjøre vil resultere i oppløsningen av flere forskjellige synlig grønn band på gel uten betydelige forvrengning eller smøre band. Overbelastning gel, høy vaskemiddel konsentrasjon, en feil eksempel pH, fra ikke materiale, kjører gel for fort eller for høy temperatur, og en feil helte gel er alle faktorer som kan bidra til dårlig løst thylakoid komplekser. Mens optimalisere forholdene i gel seg (f.eks., akrylamid gradient konsentrasjoner), kan det hje…

Materials

Glycine	Sigma	G8898
Tris base	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
Decyl Maltoside	Sigma	D7658	n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside	Sigma	O8001
Acrylamide	BioRad	161-0148	37.5/1 C 40% solution
TEMED	BioRad	161-0800
Ammonium Persulfate	BioRad	161-0700
Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Potassium Chloride	Sigma	P9333