Visualizzazione in tempo reale e analisi di condrociti lesioni dovute a carichi meccanici in espianti di cartilagine murina completamente intatta

Sommario

Presentiamo un metodo per valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni murini intatte dopo l'applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare come osteoartrite, fattori genetici e/o i regimi differenti di carico influenzano la vulnerabilità dei condrociti in situ .

Abstract

Omeostasi della cartilagine articolare dipende la vitalità delle cellule residenti (condrociti). Purtroppo, il trauma meccanico può indurre morte del chondrocyte diffusa, che portano potenzialmente al guasto irreversibile del giunto e l'insorgenza dell'osteoartrite. Inoltre, mantenimento della vitalità dei condrociti è importante nelle procedure di innesto osteocondrali per ottimale risultati chirurgici. Presentiamo un metodo per valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine intatte dopo l'applicazione di carichi meccanici controllati o impatti. Questo metodo può essere utilizzato in studi comparativi per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche, nonché diversi stadi di degenerazione della cartilagine sul breve - e/o a lungo termine vulnerabilità dei chondrocytes articolari in situ. L'obiettivo del protocollo introdotto nel manoscritto è quello di valutare l'estensione spaziale della lesione/morte delle cellule sulla superficie articolare delle articolazioni sinoviali murine. Soprattutto, questo metodo consente test su cartilagine completamente intatta, senza compromettere le condizioni al contorno native. Inoltre, consente la visualizzazione in tempo reale dei chondrocytes articolari vitale macchiato e singola analisi basata su immagini di lesione delle cellule indotta dall'applicazione di statica controllata e i regimi di carichi d'urto. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che in espianti di cartilagine sana, l'estensione spaziale della lesione delle cellule dipende sensibilmente intensità di carico di ampiezza e impatto. Il nostro metodo può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei regimi differenti di carico meccanico, differenti condizioni ambientali o manipolazioni genetiche diverse vulnerabilità della meccanica di in situ chondrocytes articolari.

Introduzione

Cartilagine articolare (AC) è un tessuto che copre e protegge le ossa nelle articolazioni sinoviali, fornire liscia articolazioni portanti. Omeostasi del tessuto sono dipendente la vitalità dei condrociti, il tipo di suola delle cellule che risiedono in AC. Tuttavia, l'esposizione della cartilagine a forze estreme dovuto il trauma (ad esempio, cadute, lesioni incidente o sport veicolo) o a causa di instabilità articolare post-traumatica può indurre la morte del chondrocyte, che conduce alla rottura irreversibile dell'articolazione (artrosi) ¹. Inoltre, in osteochondral procedure che mirano a riparare difetti localizzati in cartilagine ....

Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato approvato dal comitato di Università di Rochester sulle risorse animali.

1. soluzioni

1. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (1 X HBSS) contenenti calcio, magnesio e nessun rosso di fenolo. Aggiustare il pH a 7.4 con l'aggiunta di piccole quantità di HCl o NaOH.
2. Regolare l'osmolarità a 303 mOsm aggiungendo NaCl o acqua deionizzata. Utilizzare il buffer durante le dissezioni, preparazione dei campioni e le prove meccaniche.

2. le dissezioni del femore distale e prossimale dell'omero con cartilagine articolare completamente intatta

1. Eutana....

Risultati

Sei diversi applicati protocolli di carico (carico statico: 0,1 N, 0,5 N e 1 N per 5 min; e carico di impatto: 1 mJ, mJ 2 e 4 mJ) riproducibile indotto quantificabili aree localizzate di lesione delle cellule nella cartilagine femorale e humeral ottenuta da 8-10-settimana-vecchio (di topi BALB/c Figura 2). D'importanza, l'estensione spaziale della ferita di condrociti su superficie articolare è stato misurato rapidamente e facilmente in ImageJ. Risultati rapp.......

Discussione

I metodi sopra descritti sono stati impiegati con successo visualizzare praticabile e feriti/morti in situ chondrocytes articolari dalle articolazioni del mouse dopo prescritto impatti o carichi meccanici. In particolare, siamo stati in grado di analizzare la vulnerabilità meccanica dei condrociti all'interno della cartilagine articolare completamente intatto da due diverse articolazioni sinoviali: l'articolazione del ginocchio (femore distale) e spalla (Omero). I nostri risultati rappresentativi indicano che l'.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Calceina, AM	Invitrogen di Thermo Fisher Scientific C3100MP		20x50mg , Eugene, OR, USA
Ioduro di propidio	Invitrogen di Thermo Fisher Scientific	P3566	1 mg/mL soluzione in acqua, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	1L DMSO, anidro, ≥ 99,9%, St. Louis, MO, USA
HBSS (calcio, magnesio, senza rosso fenolo)	Gibco di Thermo Fisher Scientific	14025-092	1X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Lama chirurgica in piuma (#11)	VWR	102097-822	Hatfield, PA, USA
Osmometro a pressione di vapore, VAPRO	ELITechGroup	Modello 5520	Puteaux, Francia
Misuratore di pH	Beckman	Modello Phi 32	Brea, CA, Stati Uniti
Thermomixer Eppendorf	Eppendorf AG	Modello 5350	Amburgo, Germania
Microscopio da ricerca invertito motorizzato	Olypmus	Modello IX-81	Center Valley, PA, USA
Applicatore in legno	Puritan Medical Products Company, LLC	807	6"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Vetrini coprioggetti in vetro	Warner Instruments, LLC	64-1696	#1.5, spessore 0,17 mm, diametro 40 mm, Hamden, CT, USA