Summary
Questa carta segnala il protocollo per l'analisi di una rapida identificazione per Bemisia tabaci basato sulla tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (lampada). Il protocollo richiede un addestramento minimo laboratorio e può, pertanto, essere implementato in loco nei punti di ingresso per l'importazione di vegetali quali porti ed aeroporti.
Abstract
Le mosche bianche Bemisia tabaci (Gennadius) è un parassita invasivo di notevole importanza, che influenzano la produzione di colture vegetali e ornamentale in molti paesi del mondo. Perdite di rendimento gravi sono causate da alimentazione diretta e ancora più importante, anche dalla trasmissione di virus patogeni di più di 100 pianta nociva. Per quanto riguarda altri parassiti invasivi, aumento degli scambi internazionale facilita la dispersione di b. tabaci alle aree oltre il suo range nativo. Ispezioni di pianta importano prodotti nei punti di ingresso come porti e aeroporti sono, pertanto, visto come una misura di prevenzione importante. Tuttavia, questa ultima linea di difesa contro le invasioni di parassiti è solo efficace metodi di identificazione rapida per esemplari di insetti sospetti siano prontamente disponibili. Perché la differenziazione morfologica tra regolamentati b. tabaci e parenti stretti senza lo stato di quarantena è difficile per non-tassonomi, un saggio di rapida identificazione molecolare basato sull'amplificazione isotermica mediata da loop ( È stata sviluppata la tecnologia LAMP). Questa pubblicazione riporta il protocollo dettagliato dell'estrazione del DNA di rapida descrizione analisi Novella, set-up della reazione lampada, così come l'interpretazione della sua lettura, che permette di identificare gli esemplari di b. tabaci entro un'ora. Rispetto ai protocolli esistenti per la rilevazione di specifici b. tabaci biotipi, il metodo sviluppato si rivolge l'intero complesso in un saggio di b. tabaci specie. Inoltre il dosaggio è progettato per essere applicato in loco dagli ispettori di salute di pianta con formazione minima laboratorio direttamente nei punti di ingresso. Una completa convalida eseguita in laboratorio e in loco condizioni dimostra che il riferito lampada è uno strumento di identificazione rapida e affidabile, migliorando la gestione delle b. tabaci.
Introduction
Le mosche bianche Bemisia tabaci (Gennadius) è un insetto parassita invasivo che influenzano la resa di molte colture economicamente importanti, tra cui piante ornamentali, ortaggi, legumi da granella e cotone1,2. Al lato di danni causati attraverso il floema-alimentazione diretta, la specie di Engraving danneggia piante indirettamente l'escrezione di grandi quantità di melata sulle superfici di foglie e frutta, nonché la trasmissione di numerosi virus patogeni della pianta1 , 3 , 4. studi genetici recenti confronto tra sequenze di DNA del gene mitocondriale citocromo c ossidasi (COI) 1 ha rivelato che b. tabaci è una specie di complesso di almeno 34 morphocryptic specie3,4. Due membri altamente invasivi e dannosi all'interno di questo complesso, biotipo B proveniente dal Medio Oriente e la regione asiatica minore, così come biotipo Q originarie della regione mediterranea, sono state disperse a livello globale attraverso il trading internazionale attività con prodotti vegetali, specialmente tramite il trasporto di piante ornamentali1,5,6. Grazie al suo status di parassiti in tutto il mondo, l'Unione internazionale per la conservazione della natura e delle risorse naturali (IUCN) elencati b. tabaci come uno della "100 del mondo peggiore specie aliene invasive" e membri della specie complesse sono organismi regolamentati da molti paesi1,3,4.
Nell'Unione europea (UE), b. tabaci è elencato nella 1AI pianta salute direttiva 2000/29/CE allegato come un organismo da quarantena cui introduzione da paesi extra-UE e la sua diffusione all'interno dell'UE sono vietati4. Una misura di prevenzione essenziale contro la diffusione di organismi di quarantena è il controllo delle spedizioni di vegetali nei punti di ingresso (POEs) quali aeroporti e porti marittimi7,8. Nel caso di un organismo da quarantena viene trovato, l'organizzazione nazionale per la protezione pianta (NPPO) in carica interviene sia rifiutando o trattamento (inclusa la distruzione) della spedizione infestate9. Tuttavia, gli ufficiali ispezionando le importazioni spesso non hanno la competenza tassonomica per identificare con precisione la vasta gamma di specie di parassiti connesse con il commercio globale9. Soprattutto l'identificazione di fasi della vita immaturo (ad es., uova e larve) senza chiavi morfologiche distinte è praticamente impossibile per i tassonomi non8,9,10. Di conseguenza, per consentire l'attuazione delle misure di quarantena con un ritardo minimo, c'è un'esigenza di identificazione alternativo, rapido in loco saggi9.
Un metodo di candidato è mediata da loop isotermica tecnologia del DNA amplificazione (lampada) che ha recentemente dimostrata di essere una tecnologia adatta per l'identificazione di agenti patogeni di pianta11,12,13. LAMPADA è altamente specifico, poiché il metodo utilizza almeno due coppie di primer riconoscendo sei distinte del DNA bersaglio sequenze14. A causa dell'attività di spostamento di strand DNA della polimerasi del DNA di Bst , reazioni di lampada sono eseguite in condizioni isotermiche14. Quindi, in contrasto con la tradizionale catena della polimerasi (PCR)-base saggi non c'è alcuna necessità di un termociclatore13,14. Un altro vantaggio rispetto le analisi PCR-basata è la resilienza contro potenziali inibitori nell'estratto del DNA, eludere la necessità di un passaggio di purificazione DNA13. A causa della velocità e la semplicità del protocollo, lampada può essere eseguita anche in condizioni in loco utilizzando un portatile, batteria guidata dispositivo rilevamento in tempo reale8,15.
Un'analisi della lampada è stata progettata in risposta alla richiesta di un metodo di rapida identificazione in loco per b. tabaci8. L'obiettivo generale era di sviluppare un protocollo che può essere eseguito da ispettori sanitari pianta con limitato laboratorio formazione. Una forte attenzione è stata, pertanto, impostare su come ottimizzare la velocità e la semplicità del protocollo. Mentre test diagnostici esistenti generalmente sono stati sviluppati per l'identificazione di uno o diversi biotipi di b. tabaci, l'analisi di lampada Novella copre tutta la b. tabaci specie complesso8,16,17 ,18. Il problema della diversità pronunciate genetica all'interno-taxon del complesso è stato risolto utilizzando combinazioni di insiemi differenti dell'iniettore e l'applicazione di primer degenerati8. Il romanzo saggio lampada b. tabaci è progettato in modo tale che il primer target un frammento all'estremità 3' del mitocondriale COI gene8. Questo gene presenta un obiettivo adatto per diagnostica animale dosaggi perché ospita regioni conservate abbastanza per garantire la sensibilità diagnostica per una particolare specie, mentre discriminante abbastanza fra strettamente organismi19, 20. Inoltre, il gene COI è spesso usato come un marcatore genetico negli studi di genetica di popolazione e come una sequenza di firma nelle analisi di DNA barcoding, conseguente numerose voci di sequenza di DNA nel database open source come GenBank e BOLD21 ,22. Accanto le sequenze COI pubblicamente disponibili da b. tabaci, COI sequenze da specie strettamente imparentate (Aleurocanthus spp [N = 2], Aleurochiton pioppo, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaee Trialeurodes spp [N = 4]) erano inclusi nel disegno dell'iniettore di questo studio e utilizzato per la valutazione diagnostica sensibilità e specificità in silico8 .
A causa della precisione del metodo, la sua velocità (< 1h) e la semplicità del protocollo, il dosaggio è stato indicato per essere adatto per applicazione in loco quando implementato come parte della procedura di controllo della importazione in un POE svizzero8.
Protocol
1. preparati
- Preparando le aliquote della soluzione alcalina di estrazione del DNA.
- Produrre uno stock di soluzione alcalina di estrazione di DNA usando acqua di grado molecolare completata con 600 µM di idrossido di potassio (KOH) e 2 µM Rosso cresolo.
Attenzione: KOH è una base forte disciolta in acqua. Evitare fuoriuscite e pelle e contatto con gli occhi. - Dispensare 30 µ l di soluzione alcalina di estrazione del DNA (preparata al punto 1.1.1) in provette per microcentrifuga da 0,5 mL e conservare le aliquote a 4 ° C.
Nota: Utilizzare la soluzione di estrazione DNA aliquotata entro 1 anno.
- Produrre uno stock di soluzione alcalina di estrazione di DNA usando acqua di grado molecolare completata con 600 µM di idrossido di potassio (KOH) e 2 µM Rosso cresolo.
- Preparazione di b. tabaci amplificazione positiva controllo (PAC).
- Generare ampliconi PCR del frammento del DNA bersaglio lampada.
Nota: Un'introduzione in pratiche e principi generali di PCR è data da Lorenz23.- Sintetizzare o ottenere i primer C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') e TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ′) amplificare un frammento del mitocondriale COI gene24,25.
- Impostare la reazione di PCR come descritto nella tabella 1. Utilizzare Estratto di DNA (Vedi punto 2.1) di un esemplare di b. tabaci riferimento come modello di DNA.
Nota: Facoltativamente, è possibile estrarre il b. tabaci DNA per la PAC utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. - Programmare un termociclatore usando le seguenti condizioni: 15 min a 95 ° C; 45 cicli di 40 s a 95 ° C, 15 s a 45 ° C, rampa oltre 60 s a 60 ° C, 2 min a 72 ° C; 7 min a 72 ° C; tenere a 4 ° C.
- Pulire il prodotto di amplificazione di PCR utilizzando un kit di pulizia PCR commerciale secondo il protocollo del produttore ed eluire il prodotto finale in acqua di grado molecolare.
- Utilizzare un kit commerciale con colorante intercalanti del DNA per misurare la concentrazione di DNA del prodotto di amplificazione della PCR secondo le istruzioni del produttore e diluire con acqua grado molecolare a una concentrazione di 1 ng / µ l. Store l'amplificazione di PCR diluito prodotto come soluzione di riserva di PAC a-20 ° C.
Nota: Utilizzare la soluzione di riserva di PAC entro 1 anno. - Integrare la soluzione madre di PAC (preparata nel passaggio 1.2.1.5) con 0,6 µM KOH e diluire con acqua grado molecolare a una concentrazione di 5 x 10-3 ng / µ l. conservare il prodotto a 4 ° C.
Nota: Utilizzare il PAC entro 5 ore per la preparazione di ready-to-use b. tabaci lampada Kit descritto nel passaggio successivo.
- Generare ampliconi PCR del frammento del DNA bersaglio lampada.
-
Preparazione ready-to-use b. tabaci lampada kit (protocollo per 20 unità)
- Uso le forbici per tagliare strisce di 8-tubo lampada in due strisce di lampada 4 tubi.
- Etichettare le provette delle strisce lampada 4 tubi secondo lo schema illustrato nella Figura 1.
- Preparare b. tabaci lampada reazione mastermix (protocollo per 80 reazioni).
- 1195.1 µ l di ready-to-use GspSSD isotermici mix master (contenente GspSSD polimerasi, pirofosfatasi, solfato di magnesio, deossinucleotidi, tintura di doppio filo legante DNA binding) e 717,4 µ l di miscela di b. tabaci lampada primer a un 2 mL tubo del microcentrifuge. Centrifugare brevemente vortice e impulso.
- Dispensare 22,5 µ l di b. tabaci lampada reazione mastermix (preparata al punto 1.3.3.1) in ogni provetta di 4 tubi lampada strisce (preparato in passaggio 1.3.1) e centrifuga di impulso.
- Centrifugare il vortice della b. tabaci lampada PAC (preparata al punto 1.2) rapidamente e impulso. Quindi, aggiungere 2,5 µ l nella provetta etichettata con "PAC" di ogni striscia di lampada 4 tubi (Figura 1).
- Kit di chiusura coperchi e archivio ready-to-use b. tabaci lampada unità a-20 ° C.
Nota: Utilizzarli entro 1 anno.
2. Sportello lampada analisi
- Estrazione del DNA
- Utilizzare stuzzicadenti sterili per trasferire gli esemplari di insetti nelle provette microcentrifuga 0,5 mL contenente 30 µ l di soluzione di estrazione del DNA (preparata al punto 1.1.2).
Nota: Assicurarsi che gli insetti sono immersi nella soluzione di estrazione. - Incubare i campioni per 5 min a 95 ° C in un thermomixer (300 giri/min). Centrifugare brevemente vortice e impulso.
- Utilizzare stuzzicadenti sterili per trasferire gli esemplari di insetti nelle provette microcentrifuga 0,5 mL contenente 30 µ l di soluzione di estrazione del DNA (preparata al punto 1.1.2).
-
Analisi della lampada di b. tabaci
- Disgelo una ready-to-use b. tabaci lampada kit preparato al punto 1.3. Vortice rapidamente e centrifuga di impulso.
Nota: Con ogni kit, è sia possibile per due diversi esemplari di prova o per analizzare l'Estratto di DNA di un esemplare in duplicato. - Aggiungere 2,5 µ l di campione estratto di DNA (preparata al punto 2.1) nei tubi etichettati "S1" e "S2" di ready-to-use b. tabaci lampada kit (Figura 1).
- Aggiungere 2,5 µ l di pura alcalina soluzione di estrazione del DNA (preparata nella sezione 1.1) nella provetta etichettata "NAC" per il controllo di amplificazione negativo (Figura 1).
- Vortice il ready-to-use b. tabaci lampada kit rapidamente e centrifuga di impulso.
- Inserisci il ready-to-use b. tabaci lampada Kit nel dispositivo di analisi di lampada (con misurazione della fluorescenza in tempo reale) o una piattaforma Real-Time PCR ed eseguire un'analisi di amplificazione di DNA isotermica a 65 ° C per 60 min.
- Misurare le temperature di fusione dei prodotti di amplificazione del DNA di riscaldamento fino a 98 ° C con un passaggio successivo raffreddamento (velocità di rampa di 0.05 ° C/s) a 75 ° C, mentre si misura la fluorescenza in tempo reale.
- Disgelo una ready-to-use b. tabaci lampada kit preparato al punto 1.3. Vortice rapidamente e centrifuga di impulso.
- Lettura del saggio di lampada
- Convalidare la lettura lampada manualmente come segue.
- Se amplificazioni del DNA sono stati misurati per il campione e la PAC, nessuna amplificazione del DNA è stata misurata per il NAC, e la temperatura di annealing dei prodotti di amplificazione sono stati tra 80,0 e 85,5 ° C, considerare i risultati di lampada come positivo (Figura 2).
- Se non c'è nessuna amplificazione di DNA per i campioni (cioè, tubi etichettati S1 e S2) ma per PAC e NAC allora considerare il risultato di lampada come negativo (Figura 2).
- Se l'amplificazione del DNA è stata misurata per i campioni, ma le temperature di ricottura dei prodotti di amplificazione corrispondenti erano di fuori della gamma 80,0 \u2012 85,5 ° C, o PAC ha dato nessuna amplificazione di DNA e/o NAC ha dato un'amplificazione di DNA, considera il risultato di lampada come Non valido (Figura 2).
- Facoltativamente, convalidare la lettura lampada utilizzando l'applicazione di convalida lampada (file supplementare 1).
- Definire la specie di destinazione e il numero di campioni testati. Fare clic sul pulsante "Genera Report" .
- Trasferire la lettura (amplificazione del DNA sì/no, ricottura prodotto di amplificazione di temperatura, risultati di PAC e di NAC) dal dispositivo di analisi in loco lampada o piattaforma Real-Time PCR per i campi di input corrispondenti dell'applicazione convalida. Il risultato della convalida viene visualizzato immediatamente dopo aver inserito i dati.
- Convalidare la lettura lampada manualmente come segue.
Representative Results
Durante la convalida del test b. tabaci lampada, esemplari di insetti intercettati nel corso del processo di controllo regolare importazione in Svizzera sono stati analizzati8. Gli esemplari ha provenuto da otto paesi diversi (Isole Canarie, Repubblica Dominicana, Israele, Malesia, Marocco, Singapore, Thailandia e Vietnam) e riflettono la diversità genetica di b. tabaci trovato alla POEs europea8. Tutti i risultati di lampada erano Croce-convalidato dal DNA barcoding8.
Da un totale di 80 esemplari analizzati dalla lampada, 75 esemplari (93,8%) sono stati correttamente identificati come b. tabaci (true-positivi), due esemplari (2,5%) sono stati correttamente identificati come non essendo b. tabaci (true-negativi) e tre esemplari (3,8%) sono stati erroneamente identificati come non essendo b. tabaci (falsi negativi) (tabella 2)8. I risultati di correggere-negativi ha avuto originari da due esemplari di Trialeurodes vaporariorum , una specie ad alto rischio deve essere confuso con b. tabaci presso POEs per pianta prodotti8non regolamentati. Basato su questi risultati, sono state calcolate le seguenti misure di accuratezza diagnostica: test di specificità (tasso vero negativo), 100%; test di sensibilità (tasso vero positivo), 96,2%; testare l'efficienza (percentuale dei risultati del test corretto), 96,3% (tabella 2)8. Nel valutare la sensibilità analitica (limite di rilevazione), il saggio di b. tabaci lampada amplificato con successo DNA campione diluito a 100 fg / µ l in tutto tre replicati tecnici (tabella 3).
Un sottoinsieme dei saggi (N = 13) è stata eseguita in condizioni in loco presso l'aeroporto di Zurigo Svizzera POE da ispettori sanitari pianta utilizzando il ready-to-use b. tabaci LAMP Kit8. Quando Croce-convalidato nel laboratorio di riferimento, tutti i risultati dal test in loco sono stati trovati per essere corretta (test efficienza = 100%)8. Valutare le prestazioni del test lampada in loco, il tempo medio a positivo (ora fino a un risultato positivo era disponibile) era 38,4 ± 10,3 min (media ± deviazione standard)8. Una rappresentanza trama di amplificazione di DNA e il corrispondente ricottura derivato da un'analisi di b. tabaci lampada effettuato in condizioni in loco sono mostrati in Figura 3A e B. In questo esempio, campione uno e due sono stati correttamente identificati come b. tabaci indicato dall'amplificazione del DNA dopo circa 30 min (Figura 3A) insieme con le temperature di ricottura previste a circa 82 ° C (Figura 3B).
Figura 1: visualizzazione della disposizione sperimentale di una ready-to-use b. tabaci lampada kit descritto nel protocollo. S1, esempio 1; S2, esempio 2; PAC, controllo di amplificazione positiva; NAC, controllo di amplificazione negativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schema di convalida di lettura lampada. PAC: controllo di amplificazione positiva; NAC: controllo di amplificazione negativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: derivato di trama (A) e ricottura di amplificazione del DNA (B) di un'analisi di b. tabaci lampada effettuati in condizioni in loco. Fluorescenza è stata misurata in unità di intensità relativa. Linea verde, esempio 1; linea arancio, esempio 2; linea blu, controllo di amplificazione negativo (NAC); linea rossa, controllo di amplificazione positiva (PAC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente | Stock conc. | Reazione finale conc. | Volume per reazione |
| Taq polimerasi Master Mix | 2 x | 1 x | 10 Μ l |
| Primer C1-J-2195 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 Μ l |
| Primer TL2-N-3014 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 Μ l |
| Acqua di grado molecolare | - | - | 8.2 Μ l |
| Modello di DNA | - | - | 1 Μ l |
Tabella 1: preparazione di mastermix di reazione di PCR per la B. tabaci controllo di amplificazione positiva. Componenti e concentrazioni state necessarie per impostare una reazione di PCR. Il volume di reazione finale è di 20 µ l. sequenze dell'iniettore sono mostrati in 1.2.1.1.
| N | NTP | NFP | NTN | NFN | SEN (%) | SPE (%) | FEP (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96,2 | 100 | 96,3 |
Tabella 2: Risultati di B. tabaci Validazione di test lampada. N, numero di analisi; NTP, numero di risultati: vero-positivo; NFP, numero di risultati falsi-positivi; NTN, numero di risultati: vero-negativo; NFN, numero di risultati falsi-negativi; SEN, sensibilità diagnostica; SPE, specificità diagnostica, FEP, testare l'efficienza.
| CDNA (fg / µ l) | NPR |
TP (min) (media ± DS) |
TA (° C) (media ± DS) |
| 1 x 105 | 3 | 33,5 ± 2,9 | 81,3 ± 0,1 |
| 1 x 104 | 3 | 30,7 ± 1.1 | 81 ± 0.0 |
| 1 x 103 | 3 | 40,4 ± 3,9 | 81,1 ± 0,1 |
| 1 x 102 | 3 | 50,7 ± 1.6 | 81,1 ± 0,1 |
| 1 x 101 | 0 | - | - |
| 1 x 100 | 0 | - | - |
Tabella 3: sensibilità analitica (limite di rilevabilità) della B. tabaci saggio lampada. Ogni diluizione è stato testato in triplici copie. CDNA, la concentrazione di DNA per reazione; NPR, replica numero di positivi; TP, tempo fino a un risultato positivo era disponibile; TA, ricottura temperatura; DS, deviazione standard.
Discussion
La capacità di identificare con precisione gli organismi potenzialmente nocivi senza ritardo rappresenta un aspetto critico per la gestione dei parassiti specie9,10,26. Oltre ad essere rapida, per i prodotti di importazione di vegetali, un metodo di identificazione dei parassiti ideale dovrebbe essere semplice da eseguire in loco a POEs8,26. Questa carta segnala il protocollo di un'analisi novella di lampada per la rapida identificazione di b. tabaci, un organismo da quarantena insetto frequentemente intercettato alle frontiere europee (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-relazione _2016.pdf).
La spiegazione razionale dietro lo sviluppo del test diagnostico era quello di progettare un protocollo facile da seguire che possa essere eseguito durante la procedura di controllo di importazione pianta dagli ispettori di salute di pianta con formazione minima di laboratorio. Al fine di rendere in loco test rapido e semplice possibile, il protocollo è diviso in due parti, la preparazione di un kit di ready-to-use e le effettive prestazioni del dosaggio lampada. La prima parte può essere fatto in un laboratorio esterno affinché l'ispettore sanitario pianta possa eseguire l'estrazione del DNA e test lampada in loco con un solo passo di pipettaggio.
Però solo un passo, pipettaggio piccole quantità di liquido può essere difficile per gli utenti con poca o nessuna esperienza di laboratorio. Per risolvere questo problema, un colorante (rosso cresolo) viene aggiunto alla soluzione di estrazione, in modo che l'operatore può confermare visivamente che la piccola quantità (cioè, 2,5 µ l) di DNA viene trasferita correttamente al rispettivo tubo. Un'altra importante semplificazione del protocollo è l'applicazione di convalida in quanto facilita un'interpretazione affidabile di read-out la lampada (file supplementare 1).
Il romanzo saggio lampada b. tabaci convalidato in laboratorio e le condizioni in loco testando intercettati durante il processo di controllo di importazione regolare della Svizzera8esemplari di insetti. In totale, 80 esemplari da tre continenti, Africa, Eurasia e Nord America, sono stati analizzati dalla lampada. Degli 80 esemplari, solo tre (3,8%) sono stati erroneamente identificati (falsi negativi)8. Analizzando le sequenze di DNA primer destinazione degli esemplari falsi negativi, è stato trovato che erano nuovi aplotipi di b. tabaci che finora non sono stati descritti8. Basato su questi risultati, il set di primer di b. tabaci lampada è stato modificato e ri-convalidato con successo di8.
Uno dei principali limiti di qualsiasi metodo basato sull'amplificazione del DNA compreso lampada è che essi identificano solo pre-definiti target DNA sequenze8,27. È pertanto fondamentale garantire accuratezza diagnostica8,27una conoscenza approfondita della variazione genetica trovata nella sequenza di destinazione del primer. Tuttavia, tali informazioni sono spesso molto limitati, soprattutto nel caso di nuovi parassiti specie8. Anche se raro, risultati falso-negativi causati da mutazioni nella sequenza di destinazione sono previsti8. Nel caso del presente saggio di b. tabaci lampada, una soluzione per questo problema è la combinazione con una tecnologia basati su codici a barre del DNA, una strategia realizzata nel corso dell'attuazione di questo test diagnostico al POE Zurigo aeroporto8. Qui, tutti i risultati di lampada-negativi ri-sono stati analizzati da un laboratorio esterno8DNA barcoding. Nel caso in cui viene rilevato un aplotipo di romanzo dei parassiti non ancora descritto, i primer di lampada possono essere modificati utilizzando la sequenza di DNA generata nel processo barcoding8. Quindi, la conseguente perdita di velocità in caso di un risultato negativo di lampada è compensata per la massima accuratezza diagnostica assicurata in questo processo in due fasi8.
I costi di set-up per test lampada corrente a un POE sono circa USD 25.000. Con il crescente numero di prove di lampada sviluppato per organismi nocivi ai vegetali (ad es., Erwinia amylovora, Flavescenza dorata e Guignardia citricarpa), un investimento una tantum apparirà giustificato13,15, 28. Tuttavia, il protocollo potrebbe potenzialmente essere modificato per ridurre questi costi ancora di più. Ad esempio, per l'estrazione di DNA passo a 95 ° C, il miscelatore termo usato qui potrebbe essere sostituito da un bagno di acqua meno costoso, o eseguendo questo passaggio direttamente nel dispositivo lampada tempo reale. Inoltre, la procedura di miscelazione il vortice probabilmente potrebbe essere sostituita, spostando manualmente i tubi, e in fase di trasferimento del DNA il pipettatore potrebbe essere sostituito da inoculazione sterile loops.
Futuri miglioramenti per una rapida identificazione di specie b. tabaci e parassiti in generale potrebbero essere un'implementazione di un approccio di sequenziamento in loco che permettesse di eseguire le analisi del DNA barcoding presso POEs. Un sistema di candidati promettenti per tale attuazione è la tecnologia di sequenziamento nanopore. Infatti, la tecnologia recentemente è stata implementata con successo nel tentativo di codici a barre del DNA in loco per valutare la biodiversità di una foresta pluviale8,29,30. Un sistema di identificazione di codici a barre del DNA in loco può sostituire completamente la necessità per lo sviluppo di test diagnostici mirati e la loro convalida. Inoltre permette la raccolta di ulteriori informazioni sulle caratteristiche dei parassiti quali pesticidi resistenza geni8. Tuttavia, fino a quando non saranno attuate ordinariamente tecnologie di sequenziamento romanzo, il saggio di b. tabaci lampada rappresenta una rapida (< 1h) e metodo di identificazione accurata.
Disclosures
L'autore Michael Andreou è azionista di OptiGene Limited che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati a Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun e Sven Moeller per partecipare la convalida del test lampada b. tabaci .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
- Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
- Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
- Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
- Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
- Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
- Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
- Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
- Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
- Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
- Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
- Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
- Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
- Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
- Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
- Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
- Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
- Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
- Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
- Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
- Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
- Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
- Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).
