Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo
Summary
Die Proteinsynthese ist ein kritischer biologischer Prozess für Zellen. Im Gehirn ist es für adaptive Veränderungen erforderlich. Die Messung der Raten der Proteinsynthese im intakten Gehirn erfordert sorgfältige methodische Überlegungen. Hier stellen wir die l-[1-14C]-eucinquantitative autoradiographische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo vor.
Abstract
Proteinsynthese ist für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der neuronalen Funktion erforderlich und ist an adaptiven Veränderungen im Nervensystem beteiligt. Darüber hinaus wird angenommen, dass dysregulation der Proteinsynthese im Nervensystem ein Kernphäpnotyp bei einigen Entwicklungsstörungen sein kann. Eine genaue Messung der Raten der zerebralen Proteinsynthese in Tiermodellen ist wichtig, um diese Störungen zu verstehen. Die Methode, die wir entwickelt haben, wurde entwickelt, um auf das Studium von wachen, sich verhaltenden Tieren angewendet zu werden. Es ist eine quantitative autoradiografische Methode, so dass es Raten in allen Regionen des Gehirns gleichzeitig liefern kann. Die Methode basiert auf der Verwendung einer Tracer-Aminosäure, L-[1-14C]-Leucin, und einem kinetischen Modell des Verhaltens von L-Leucin im Gehirn. Wir haben uns für L-[1-14C]-Leucin als Tracer entschieden, da es nicht zu fremd gekennzeichneten Stoffwechselprodukten führt. Es wird entweder in Protein eingliedert oder schnell metabolisiert, um 14CO2 zu ergeben, das in einem großen Pool von unbeschriftetem CO2 im Gehirn verdünnt wird. Die Methode und das Modell ermöglichen auch den Beitrag von unbeschrifteten Leucin aus Gewebeproteolyse in den Gewebevorläuferpool für die Proteinsynthese. Die Methode hat die räumliche Auflösung, um Proteinsyntheseraten in Zell- und Neuropilschichten sowie hypothalamische und schädelige Nervenkerne zu bestimmen. Um zuverlässige und reproduzierbare quantitative Daten zu erhalten, ist es wichtig, sich an Verfahrensdetails zu halten. Hier stellen wir die detaillierten Verfahren der quantitativen autoradiographischen L-[1-14C]-Leucin-Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der Proteinsynthese in vivo vor.
Introduction
Die Proteinsynthese ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für eine langfristige adaptive Veränderung des Nervensystems erforderlich ist1. Hemmende Proteinsynthese blockiert die Langzeitspeicherspeicherung bei Wirbellosen und Wirbeltieren2. Proteinsynthese ist wichtig für die Aufrechterhaltung der späten Phasen einiger Formen der Langzeitpotenzierung (LTP) und Langzeitdepression (LTD)3, neuronale Überleben während der Entwicklung4, und für die allgemeine Wartung des Neurons und seiner synaptische Verbindungen5. Die Messung der Raten der Proteinsynthese des Gehirns kann ein wichtiges Werkzeug sein, um adaptive Veränderungen sowie neuroentwicklungsbedingte Störungen und Störungen im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis zu studieren.
Wir haben eine Methode entwickelt, um die Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo in einem wachen Tier zu quantifizieren, das inhärente Vorteile gegenüber anderen Techniken bietet, die Raten in ex vivo oder In-vitro-Präparaten von Hirngewebe schätzen6. Vor allem die Anwendbarkeit auf Messungen im intakten Gehirn eines wachen Tieres. Dies ist eine wichtige Überlegung, weil es Messungen mit synaptischen Struktur und Funktion an Ort und Stelle und ohne Bedenken über post-mortem Effekte ermöglicht. Darüber hinaus erreicht der von uns einsetzende quantitative autoradiografische Ansatz einen hohen Grad an räumlicher Lokalisierung. Während die Energie von 14C so ist, dass wir den Tracer nicht auf subzellulärer oder zellulärer Ebene lokalisieren können, könnenwir Raten in Zellschichten und kleinen Hirnregionen wie hypothalamischen Kernen mit einer Auflösung von etwa 25 m 7 messen.
Eine Herausforderung bei In-vivo-Messungen mit Radiotracern besteht darin, sicherzustellen, dass das gemessene Radiolabel im Produkt der Reaktion von Interesse liegt und nicht unreagierte gekennzeichnete Vorläufer oder andere fremdmarkierte Stoffwechselprodukte6. Wir haben L-[1-14C]-Leucin als Tracer-Aminosäure gewählt, weil es entweder in Protein eingliedert oder schnell zu 14CO2 metabolisiert wird, das in dem großen Pool von unbeschriftetem CO2 im Gehirn verdünnt wird, das aus der hohen Rate von Energiestoffwechsel8. Darüber hinaus existiert jedes 14C, das nicht in Proteine eingearbeitet ist, in erster Linie als freies [14C]-Leucin, das während der 60-min-Versuchsphase fast vollständig aus dem Gewebe6. Proteine werden dann mit Formalin am Gewebe fixiert und anschließend mit Wasser abspült, um freies[14C]-Leucin vor der Autoradiographie zu entfernen.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Frage der Verdünnung der spezifischen Aktivität des Vorläufer-Aminosäurepools durch unbeschriftete Aminosäuren aus Gewebeproteolyse. Wir haben gezeigt, dass bei erwachsenen Ratten und Mäusen etwa 40% des Vorläufer-Leucin-Pools für die Proteinsynthese im Gehirn aus Aminosäuren stammt, die aus dem Proteinabbau6gewonnen wurden. Dies muss in die Berechnung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese (rCPS) einbezogen werden und muss in Studien bestätigt werden, in denen sich diese Beziehung ändern kann. Die theoretische Grundlage und die Annahmen der Methode wurden an anderer Stelle ausführlich dargestellt6. In diesem Papier konzentrieren wir uns auf die Verfahrensfragen bei der Anwendung dieser Methode.
Diese Methode wurde für die Bestimmung von rCPS in Bodenhörnchen9, Schafe10, Rhesusaffen11, Ratten12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, ein Mausmodell des Tuberöse-Sklerose-Komplexes22, ein Mausmodell des fragilen X-Syndroms23,24,25,26, fragile X-Prämutationsmäuse27und ein Mausmodell von Phenylketonuria28. In diesem Manuskript stellen wir die Verfahren zur Messung von rCPS mit der in vivo autoradiographischen L-[1-14C]-Leucin-Methode vor. Wir präsentieren rCPS in Hirnregionen einer wachen Kontrollmaus. Wir zeigen auch, dass die In-vivo-Verabreichung von Anisomycin, einem Inhibitor der Translation, die Proteinsynthese im Gehirn abschafft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen eine quantitative Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese (rCPS) in vivo bei Versuchstieren vor. Diese Methode hat erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden: 1. Messungen werden im wach laufenden Verhalten des Tieres durchgeführt, so dass sie laufende Prozesse im funktionierenden Gehirn widerspiegeln. 2. Messungen werden mittels quantitativer Autoradiographie durchgeführt, die die Möglichkeit bietet, rCPS in allen Regionen und Subregionen des Gehirns gleichzeiti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Zengyan Xia für die Genotypisierung der Mäuse, Tom Burlin für die Verarbeitung von Aminosäuren und Filmen und Mei Qin für die Durchführung einiger rCPS-Experimente würdigen. Diese Forschung wurde durch das Intramural Research Program des NIMH, ZIA MH00889, unterstützt. RMS wurde auch von einem Autism Speaks Postdoctoral Fellowship 8679 und einem FRAXA Postdoctoral Fellowship unterstützt.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
Riferimenti
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