Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo
Summary
Describimos los métodos de etiquetado fluorescente tangencial migrar las células por electroporación y para Time-lapse de imágenes del movimiento celular marcada en una cultura de plano-montaje para visualizar migración celular comportamiento en El tectum óptico de chick en desarrollo .
Abstract
Proyección de imagen de Time-lapse es un método poderoso para analizar el comportamiento de células migratorias. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento de las células marcadas en la cultura puede grabarse bajo microscopia video. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se utiliza comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como la migración de la célula radial. Sin embargo, la información limitada puede obtenerse desde el método de cultura rebanada para analizar la migración de la célula perpendicular a la sección de corte, como migración tangencial. Aquí, presentamos los protocolos para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico de chick en vías de desarrollo. Una combinación de etiquetado celular por electroporación de ovo y una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de movimiento de migración celular en el plano horizontal. Además, nuestro método facilita la detección de comportamiento de células individuales y la acción colectiva de un grupo de células a largo plazo. Potencialmente, este método puede aplicarse para detectar el cambio secuencial de la etiqueta fluorescente micro-estructura, incluyendo la elongación axonal en el desplazamiento de tejido o células neuronal en el tejido no neural.
Introduction
El estudio de la migración de la célula ha sido avanzando con la técnica de avance de la proyección de imagen vivo. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento temporal de células marcadas en una placa de cultivo o en vivo puede grabarse bajo microscopia video. En el estudio del desarrollo neuronal, se han analizado los cambios morfológicos de migración de las células o alarga axones usando proyección de imagen de Time-lapse. Para la proyección de imagen efectiva, es esencial aplicar un método adecuado para la preparación de tejido y etiquetado fluorescente de la célula, basado en el propósito del experimento y el análisis. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se ha utilizado comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como célula radial migración1,2,3. El sistema de cultivo del sector también se utiliza para detectar células tangenciales migración4,5, pero no es adecuado para análisis direccional en casos donde las células dispersan perpendicular a la sección de corte.
El tectum óptico se compone de una estructura multicapa, formada por la migración radial y tangencial de la célula durante el desarrollo embrionario. Formación de la capa tectal depende principalmente de la migración radial de las células precursoras neuronales postmitotic desde la zona ventricular y su destino final en las capas se correlaciona con su fecha de nacimiento en la zona ventricular6. En cuanto a la migración tangencial, habían divulgado previamente dos flujos de migraciones en las capas intermedias y superficiales en un tectum óptico de chick en vías de desarrollo. En las capas medias en E6-E8, las células bipolares con un líder largo proceso y un proceso final fino migran dorsal o ventralmente a lo largo de la Unión de axon de tectal axones eferentes que dorso-ventralmente7. Después de esta migración de axophilic, las células se diferencian en neuronas multipolares situadas en las capas profundas. En las capas superficiales durante E7-E14, migración de las células dispersa horizontalmente por reformar un proceso principal ramificado y dispersión en múltiples direcciones8. Después de la dispersión de la migración, las últimas células eventualmente se diferencian en neuronas superficiales de diferentes morfologías. En ambos casos, una cultura de plano-montaje es eficaz para observar movimiento celular paralela a la superficie pial.
Aquí, presentamos un protocolo para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico polluelo en desarrollo7,8. Combinación de etiquetado celular por electroporación de ovoy una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de migración dirección de movimiento y migración de célula. El objetivo de este método es facilitar la detección de ambos comportamiento de células individuales en el largo plazo y la acción colectiva de un grupo de células en el plano horizontal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito anteriormente está optimizado para detectar la migración celular en capas superficiales6,8. Es aplicable para la detección de capa media migración arroyos (película 5)6,7, cambiando el momento de la electroporación (E5.5 a E4.5) y el inicio de la cultura y la proyección de imagen (E7.0 a E6.0).
El procedimiento pre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por JSP KAKENHI número 15K 06740 a Y.W.
Materials
| Materials | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | endotoxin-free plasmid DNA purification kit |
| 20 ml syringe | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 gauge needle | TERUMO | NN-1838R | |
| Fast Green | Wako | 061-00031 | |
| 100x penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| glass capillary tube | Narishige | G-1 | |
| cell culture insert | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| Laminin | SIGMA | L2020 | coating of culture insert |
| poly-L-Lysine | Peptide Institute | 3075 | coating of culture insert |
| glass bottom dish | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | culture medium |
| F12 | Gibco | 11765-054 | culture medium |
| fetal bovine serum | Gibco | 12483 | culture medium |
| chick serum | Gibco | 16110082 | culture medium |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| microsurgical knife | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| curved scissors | AS ONE | No.11 | |
| micropipette processor | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| forceps-type electrode | BEX | LF646P3x3 | |
| pulse generator | BEX | CUY21EX | electroporator |
| fluorescence stereoscopic microscope | Leica | MZ16F | |
| inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| gas controller | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| temperature controller | Tokai Hit | MI-IBC | |
| laser confocal unit | Olympus | FV300 |
Riferimenti
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