Summary
Этот протокол обеспечивает эффективный подход к измерению LDL холестерина поглощения с показателями притока реального времени с использованием живой клетки системы в различных типах клеток. Эта техника обеспечивает платформу для фармакологической активности соединений, затрагивающих ЛПНП приток во время мониторинга для морфологии клеток и поэтому потенциальные цитотоксичность на экране.
Abstract
Регулирование LDL холестерина поглощения через LDLR-опосредованный эндоцитоз является важной областью исследования в различных основных патологий, включая метаболические расстройства, сердечно-сосудистые заболевания и заболевания почек. В настоящее время существует не доступный метод для оценки поглощения ЛПНП при одновременно мониторинга здоровья клеток. Настоящее исследование представляет протокол, с помощью системы анализа изображений живой клетки, приобрести последовательных измерений ЛПНП притока с параллельного мониторинга здоровья клеток. Этот роман технику испытывается в трех линий клеток человека (печеночная, почечная трубчатых эпителиальных и коронарной артерии эндотелиальных клеток) за 4-часовой курс. Кроме того чувствительность этого метода проверяется с известным ингибиторы, Dynasore и рекомбинантных белков PCSK9 ЛПНП, а также ЛПНП поглощение промоутер, симвастатин. Вместе взятые, этот метод обеспечивает платформу средняя высокая пропускная способность для одновременно скрининг фармакологической активностью, а также мониторинг морфологии клеток, поэтому цитотоксичность соединений, регулирующий приток ЛПНП. Анализ может использоваться с различными системами визуализации и аналитического программного обеспечения.
Introduction
ЛПНП, низкой плотности липопротеинов LDLR рецептор-опосредованный эндоцитоз является важной областью исследования, поскольку циркулирующего уровня холестерина ЛПНП в ядро1сердечно-сосудистых заболеваний, почечной болезни2 , а также различных воспалительных болезни3 и генетических расстройств с мутациями в холестерин транспорта генов4,5,6,7. Исследования в LDLR-опосредованной холестерина приток привели к идентификации нескольких исследовательских инструментов, например ингибиторов Динамин, включая химические Dynasore8,9,10, а также ЛПНП регулирующая белки такие Proprotein конвертазы Субтилизин/Kexin тип 911,(PCSK9)12.
Пути эндоцитоза ЛНП-LDLR начинается с поглощения ЛНП-LDLR комплекс на поверхности клеток в Клатрин покрытием ямы-13. Везикулы образуются затем invagination клеточной поверхности мембраны интернализации ЛНП-LDLR комплекс в вакуолей для транспорта внутри клетки. Как сформированные везикул созревает в ранний и поздний затем endosomes, рН капель внутри конце endosome, вызывая диссоциации ЛПНП от его рецептор14. В прошлом методы количественной оценки ЛПНП приток зависит от Радио меченых 125-ЛПНП Сопредседатель инкубации с клетки и последующего извлечения из клеток для количественной оценки15цианокобаламина, меченного белка. Это затем был заменен использование дневно помечены ЛПНП белков например DiI-ЛПНП и последующей иммуноокрашивания или извлечения белков для флуоресцентных чтений, используя спектрофотометр или пластины читателя15,16. Дневно помечены ЛПНП также использовался в активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) для анализа интернализации ЛПНП и клеток поверхности ЛПНП привязки17. Хотя эти методы позволяют сбора данных после лечения, мониторинг жизнеспособность клеток во время лечения не возможен.
Кислой рН в конце endosome позволяет использовать рН активированный флуоресцентного ЛПНП зонда как pHrodo красный ЛПНП, которая флуоресцирует после интернализации18,19. Это свойство позволяет курс время непрерывной оценки поглощения ЛПНП в живых клеток. Таким образом этот протокол использует pHrodo красный-ЛПНП флуоресценции изображений в жить анализа клеток для серийно мера ЛПНП поглощения с параллельного мониторинга здоровья клеток. Результаты свидетельствуют о надежности этой новой техники как протестированного 4-часовой курс в три разных человека клеточных линий, клетки человека рак печени (HepG2), человека почечных клеток эпителия (HK2) и человека коронарных артерий эндотелиальных клеток (HCAEC ). Эти клеточные линии клинически значимых для ЛПНП Распродажа20,21,,2223,24,25,26,27 , почечной болезни28,,2930,31и болезни сердца32,33, соответственно. Помимо контроля за притоком ЛПНП, этот протокол включает в себя лечение с двух известных ЛПНП ингибиторы, Dynasore гидрата и Рекомбинантный белок PCSK9, а также статинов индуктором выражение LDLR и поглощения ЛПНП, симвастатин. Dynasore и рекомбинантные PCSK9 каждого работать через различные пути, чтобы уменьшить поглощение ЛПНП.
Dynasore – это небольшая молекула ингибитор Dynamins10 и уменьшает поглощение ЛПНП, блокируя Клатрин зависимых эндоцитоза ЛНП-LDLR комплекс10,34. Рекомбинантных PCSK9, с другой стороны, является членом пептидаза S8 семьи, которая связывается с LDLR и препятствует его переработки на поверхности клеток после выпуска ЛПНП от интернализированных комплекса, блокируя необходимые конформационные изменения35,36 . Поверхностная плотность LDLR снижение клеток в конечном итоге приводит к снижение ЛПНП поглощения в ячейке. Статины, хотя непосредственно блокирования фермента редуктазы 3-гидрокси-3-methylglutaryl кофермент (HMG-CoA) и таким образом биосинтез холестерина, также известны upregulate выражение LDLR25,38 ведет к увеличению поглощения ЛПНП. Чувствительность этого протокола проверяется путем обнаружения значительных сокращений в ЛПНП приток в трех клинически значимых человека клеточных линий, HK2, HepG2 и HCAECs, Dynasore и/или рекомбинантные PCSK9 и заметное увеличение поглощения ЛПНП в HepG2 клетках СИМВАСТАТИН в 4-часовой курс с мониторинга для морфологии клеток/здоровья. Взятые вместе, этот метод обеспечивает платформу средняя высокая пропускная способность для одновременно скрининг фармакологической активности и цитотоксичность соединений, регулирующих потребление LDL в живых клетках.
Protocol
1. Заполнение клеток в пластине 24-а
- Аспирационная СМИ клетки, вымыть клетки с 5 мл Dubelco фосфат буфер солевой (dPBS) и аспирационная dPBS. Для HepG2 клеток в 100 мм блюдо, используйте 1,5 мл 0,25% трипсина/ЭДТА, и для HK2 клеток или HCAECs использовать 1,5 мл 0,05% раствора трипсина/ЭДТА для отсоединения клетки.
- Инкубируйте пластину в инкубаторе 37 ° C, 4 минут, или до тех пор, пока отдельные клетки. Нейтрализовать трипсина после 4 минут инкубации, добавив 3 мл полной СМИ для HepG2 и HK2 или 3 мл трипсина, нейтрализации раствора, dPBS плюс 5% плода бычьим сывороточным (ФБС), для HCAEC клеток.
- Перевести клетки в 15 мл конические трубы и центрифуги на 250 g x 5 мин, аспирационная средства массовой информации и вновь приостановить Пелле клеток в полной СМИ.
- Фильтр суспензию клеток нежно через сетчатый фильтр размером 40 мкм разбить ячейки сгустки. Не мойте клетки через стрейнер.
- Подсчитать количество ячеек и пластины их в оптимизированный плотности. Например 5000 ячеек на хорошо HepG2 клеток или 10 000 ячеек на хорошо HK2 клетки или HCAECs в пластине 24-хорошо привести к оптимальные результаты.
- Инкубируйте пластину на ночь при 37 ° C, чтобы позволить клетки для присоединения.
- Следующий день, изменить ячейки СМИ основывать средства массовой информации для линии клетки (без FBS) плюс 5% Lipo-белка дефицит сыворотки (ЛПДС) или low (2%) FBS СМИ в зависимости от лечения (см. 1.7). Затем перейдите к инкубации за 24 ч до голодать клетки. Используйте 500 мкл всего СМИ за хорошо в пластине 24-хорошо.
- Лечить клетки в один из трех способов: добавить 10 мкг/мл rPCSK9 (или транспортного средства) и вернуть клетки до 37 ° C-инкубатор для 1 часа, добавить 40 мкм Dynasore гидрат (или транспортного средства, диметилсульфоксида) и вернуть клетки инкубатора 37 ° C на 10 минут , или добавить 1 мкм симвастатин (или транспортное средство, диметилсульфоксида) и вернуть клетки для инкубатора 37 ° C на 12, 18 или 24 часа. Использование средств массовой информации с 5% ЛПДС для rPCSK9 или Dynasore лечения. Использование низкой (2%) FBS СМИ или СМИ с 5% ЛПДС СИМВАСТАТИН лечения.
Примечание: Лечение клетки с желаемой соединений может быть сделано в то время средства массовой информации изменения для липопротеинов голода (шаг 1.6) для долгосрочных экспериментов, или до анализа для краткосрочных экспериментов. Кроме того индивидуальные обращения раз могут быть выбраны на основе типа и цель экспериментов. - Далее добавьте 5 мкл pHrodo помечены красным ЛПНП (1 мг/мл бульона) для каждой скважины для получения конечной концентрации 10 мкг/мл. Затем тщательно удалите все пузырьки из скважин.
2. жить анализа клеток
- Сразу же после добавления маркированных ЛПНП, место пластину в инкубаторе системы анализа живых клеток (см. Таблицу материалы) и позволяют пластину сбалансировать на 15 минут для уменьшения конденсации в пластине.
- В то же время откройте программу и расписание проверки путем добавления судно, имеющее пластину. Изображения 16 изображений в хорошо интервалом 1 час в 10 X 4 часа, с использованием красного и фазы каналов.
- Создайте карту пластины для обработки данных.
- Нажмите на вкладке Свойства выберите карта пластины. Входной тип ячейки и лечения в закладке соединений .
- Нажмите на вкладку регионов , выберите каждый набор реплицирует и сохранить как регионов.
3. Настройка параметров анализа
- После завершения экспериментального запуска создайте набор изображений в программном обеспечении для подготовки компьютера для количественного определения каждого параметра, включены в наборе подсчета.
- В программном обеспечении чтобы открыть пластины, а затем в поле Анализ работы утилиты выберите создать или добавить в коллекцию изображений.
- Выберите Новую коллекцию изображений, введите имя для коллекции изображений и выберите красный и фазы каналов, установив флажки рядом с каналов.
- Выберите 5 больше изображений и добавить коллекцию изображений, добавив к текущей коллекции изображений.
- Создайте определение обработки для клеток. Таблица 1 содержит параметры для HepG2, HK2 и HCAE клеток, обработку определений для этого протокола приток ЛПНП.
- В диалоговом окне Анализ работы утилиты выберите Новое определение обработки. Выберите коллекцию изображений, названный в шаге 2.1.2 из раскрывающегося меню. Входные параметры для типа клеток из таблицы 1.
- В окне предварительного просмотраиспользуйте раскрывающееся меню для выбора Предварительный просмотр всех.
- В поле Анализ маска установите флажок Маски слияния и коробки Красный объект маска для просмотра области включены в анализ для определения обработки. Смотрите Рисунок 1.
- Просмотрите коллекцию изображений, чтобы убедиться, что клетки и ЛПНП включены в маске. Выберите файл и сохранить определение обработки.
- Проанализируйте набор изображений из экспериментальной run.
- Откройте эксперимент в режиме пластины. В диалоговом окне Анализ работы утилиты выберите Запустить новое задание анализа. Выберите сохраненный определение обработки.
- Имя задания анализ, выберите диапазон времени для анализа и выделить экспериментальный скважин для анализа. Нажмите кнопку Запуск .
4. анализ и обработка данных
- После завершения анализа задания экспорта данных:
- Выберите завершения анализа и нажмите Просмотр. В меню утилиты выберите Метрики/график экспорта.
- В регионах меню выберите Все скважиныи в группу меню, для получения среднего значения для каждого набора скважин как группы выбрать реплицирует и для экспорта отдельные значения для каждой скважины выберите нет.
- В меню красный объект метрики выберите Всего красный объект интегрированной интенсивности (RCU x µm2/Image). Этот параметр указывает сумму раз интенсивности (в РКГ) красный сигнал области красного сигнала (в мкм2) во всех изображениях по каждой скважине, которая соответствует общей ЛПНП поглощение клетками.
- Нажмите кнопку « Экспорт данных ». Проверьте, разбить данные на отдельных изображений. Данные автоматически копируется в буфер обмена и может быть вставлен в новый файл электронной таблицы.
- В фазе объект метрики меню выберите слияния (%). Проверьте, разбить данные на отдельных изображений. Нажмите кнопку « Экспорт данных ». Данные автоматически копируется в буфер обмена и можно скопировать в файл электронной таблицы, содержащие данные всего красный объект интегрированной интенсивности.
- Применить преобразование процент слияния общей площади с помощью следующего уравнения.
Общая площадь фазы (µm2/Image) = слияния (%) × (высота изображения (пикселей) × резолюции) (ширина изображения (пикселей) × резолюции)
Примечание: параметр слияния (%) указывает процент слияния области фазы на изображение, которое соответствует области ячеек в каждой скважине. Эта метрика должна быть преобразована в полная фаза область для каждого изображения после экспорта. Характеристики изображения для фазы канала (высота изображения, ширина и резолюции) для использования с указанной выше формулы для каждой экспериментальной судна можно найти путем ссылки на Свойства судна по Каналам изображения. - Нормализовать всего красный объект интегрированной интенсивности и общей площади фазы рассчитывается в 4.1.6, используя следующую формулу для каждого отдельного изображения для ликвидации изменчивость плотности клеток через скважины.
- Разделите значения Всего красный объект интегрированной интенсивности (RCU x µm2/Image) каждого изображения его соответствующий Этап площадь (µm2/Image) для получения значения ЛНП поглощения (РКГ) на изображение.
- Затем в среднем ЛПНП поглощения (РКГ) данных всех изображений каждой скважины для получения Среднее поглощение ЛПНП в каждой скважины и затем средние значения поглощения ЛПНП всех реплицировать скважин для получения средств группы. Эти данные являются конечные значения поглощения ЛПНП и могут быть использованы для иллюстрации и статистический анализ с использованием программного обеспечения по выбору.
Representative Results
Живой клетки изображения позволяет для надежного контроля здоровья клеток во время исследования приток холестерина в трех линий клеток человека
Мы проверить нашего анализа в трех линий клеток человека, в котором холестерина гомеостаза регулирование играет важную роль патофизиологических, включая клетки человека рак печени (HepG2), человека почечных клеток эпителия (HK2) и эндотелиальных клеток человека коронарной артерии (HCAECs). Мы использовали систему визуализации живых клеток для выполнения пробирного поглощение ЛПНП в 4 h время курс с последовательных измерений интервалом 1 ч. Наши результаты показывают, что все типы клеток испытания были совместимы с этой новой техники и результат в кривых, указывающее непрерывное поглощение ЛПНП на время приток исследования с 4.33 h как на финальную конечную точку (рис. 2). Приток данных показано на рисунке 2 были получены путем нормализации общей pHrodo ЛПНП, помечены красной флуоресценцией (всего красный объект интегрирован интенсивности на изображение в РКГ x µm2/изображение) в ячейке области в каждом изображении каждой скважины (фаза объект области на изображении в мкг m2/Image) для устранения изменчивость плотности клеток через скважины. Кроме того для проверки чувствительности пробирного приток ЛПНП с целью проверки соединений, влияющих на поглощение холестерина LDL, мы использовали два положительных элементов управления, известных сдерживать приток ЛПНП, Dynasore и rPCSK9 и один положительный контроль, известно, чтобы побудить ЛПНП поглощение, симвастатин. Как подтверждено наши результаты, после лечения с Dynasore и rPCSK9, все три испытания линий клеток человека (HepG2, HK2 и HCAEC), показали значительное снижение ЛПНП приток над 4 h время курса (рис. 2A-C). Например, Рисунок 2A показывает, что приток ЛПНП уменьшается в HepG2 клетках с лечением Dynasore в течение времени, по сравнению с клетках, обработанных с ДМСО; во время ДМСО, как транспортное средство управления для Dynasore управления не оказало существенного влияния на приток ЛПНП, по сравнению с необработанными контрольной группы. Кроме того наши результаты показали заметное увеличение в ЛПНП усвоение клетками после лечения с симвастатин (рис. 3), поддерживая чувствительность этого метода для обнаружения значительных изменений в ЛПНП приток HepG2. В о точке времени 4,5 часа, который представляет собой типичное время точку в ЛПНП поглощение исследования, ЛПНП приток значительно снижена с Dynasore или rPCSK9 лечения и увеличился на лечение симвастатин (рис. 4).
Основным преимуществом использования живых клеток, изображений для ЛПНП поглощение исследований является, что эта система обеспечивает реального времени изображения ячеек в каждой скважине, которые могут быть использованы для отслеживания потенциальных цитотоксичность исследуемых соединений. Показатели 5-7 иллюстрируют представитель образы трех клеточных линий, расследовались в начальный момент времени точке (0,33 h) и финальную конечную точку (4.33 h) как визуальный справочник для чистого притока ЛПНП. Изображения подтверждают нормальной морфологии клеток после лечения Dynasore или rPCSK9, с указанием эффективности и безопасности этих соединений.
Живые клетки анализ дает надежные серийный количественных холестерина приток измерения с различными процедурами
Основным преимуществом использования этого протокола с живой клетки системы является возможность сбора данных на протяжении времени и сравнить ЛПНП приток в нескольких точках времени, а не только один последний момент как это традиционно делается. Используя этот протокол, мы можем вычислить процент reductionin ЛПНП приток в момент времени терминала, а также интервалы 1 час на протяжении времени. В таблице 2 резюмируются снижение ЛПНП приток в трех проверенных человека клеточных линий, после предварительной обработки 10 мин с 40 мкм Dynasore или 1 час до лечения с 10 мкг/мл rPCSK9. 4.33 h как конечную точку окончательного исследования лечение с Dynasore на 40 мкм значительно сократить приток ЛПНП в HepG2 клетки, клетки HK2 и HCAECs на 53%, 68% и 54%, соответственно (Таблица 2A-C) и лечение с rPCSK9 на 10 мкг/мл привели к 55% снижение ЛПНП приток в HK2 клетки (таблица 2B). Помимо количественного определения точки терминала время как традиционные анализов, мы в состоянии выполнить количественный анализ в снижении LDL притока из-за лечения на каждом этапе эксперимента. Например Таблица 2B показано, что лечение с rPCSK9 в HK2 клетки привело к сокращению ЛПНП поглощения на 1,33 h 79%, 67% 2,33 ч, 59% 3,33 ч после лечения, по сравнению с необработанными клеток. Этот протокол обеспечивает надежный метод количественного анализа притока ЛНП после лечения.
Рисунок 1 : Обработка определение маски. Представитель изображения HK2 клеток изображены после применения соответствующей обработки определения (подробно в таблице 1). Показано areHK2 клетки без маскировки (A), с Maskapplied этапа (B), с красной объект маска (C), или фазы и красный объект маски применяются (D). Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Снижение ЛПНП поглощения с использованием живой клетки съемочной системы на протяжении времени 4.33 h. Жить анализа клеток, что система используется для измерения ЛПНП приток в клетки человека рак печени (HEPG2) (A), человека почечной трубчатых эпителиальных клеток (HK2) (B) и человека коронарной артерии эндотелиальных клеток (HCAE) (C). Клетки с Dynasore (10 мин до запуска) или rPCSK9 (1ч до запуска) считались позитивные элементы. ДМСО был использован как средство для лечения Dynasore. Положительный контроль значительно сократилась ЛПНП приток в всех 3 клеточных линий. ЛПНП приток значения были получены путем нормализации общей красный объект интегрирован интенсивности (RCUxµm2/Image) в районе объекта полная фаза (µm2/Image). Данные являются mean±SEM. N = 6 скважин/группа. Данные являются представитель 2 или 3 независимых экспериментов. p < 0,0001 против пустым, и ###p < 0,0001 против ДМСО, используя двусторонний ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Увеличением LDL поглощения с использованием живой клетки изображений системы на протяжении времени 4.33h. Жить анализа клеток, что система используется для измерения ЛПНП приток в клетках человека рак печени (HEPG2). ЛПНП поглощение значительно увеличивается после лечения с СИМВАСТАТИН 12 h (A), 18 h (B) или 24 h (C) с помощью средств массовой информации, содержащий 2% FBS. Точка время 24 h также была исполнена с СМИ, содержащих 5% ЛПДС (без FBS). ДМСО использовался в качестве отрицательного контроля. ЛПНП приток значения были получены путем нормализации всего красный объект интегрирован интенсивности (RCU x µm2/Image) в районе объекта полная фаза (µm2/Image). Данные являются mean±SEM. N = 6 скважин/группа. Данные представляют один независимый эксперимент. p < 0,0001 против ДМСО, с помощью t критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Значительное сокращение притока ЛПНП агентами поглощения снижение ЛПНП в момент времени 4,3 ч. ЛПНП приток значительно уменьшается в клетки человека рак печени (HepG2) (A), человека почечной трубчатых эпителиальных клеток (HK2) (B) и человека коронарной артерии клетки эндотелия (HCAE) (C) после лечения с ЛПНП поглощения Ингибиторы Dynasore за 10 мин или rPCSK9 за 1 час. ЛПНП приток заметно увеличивается симвастатин в HepG2 клетках после лечения 12, 18 или 24 ч (D). Данные являются mean±SEM. N = 6 скважин/группа. Данные являются представитель 2 или 3 независимых экспериментов. p < 0,0001 с помощью двухсторонней ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Снижение ЛПНП приток в гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) клеток агентом поглощения понижая ЛНП, Dynasore. Представитель изображения фазы и красный объектов для HepG2 клетки изображены на 0,33 h (левой панели) и конечную точку 4.33 h (правой панели) показывают состояние Исправен клеток. 40 мкм Dynasore, известный для снижения LDL-холестерина поглощения, был использован в качестве позитивного управления (C). Изображения были взяты при 10-кратном. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Снижение ЛПНП приток в человека почечной трубчатые (HK2) клеток эпителия ЛПНП снижение поглощения агентов, Dynasore и rPCSK9. Представитель изображения фазы и красный объектов для HK2 клеток, изображенные на 0,33 h (левой панели) и конечную точку 4.33 h (правой панели) показывают состояние Исправен клеток. 40 мкм Dynasore (C), или 10 мкг/мл rPCSK9 (D), известный для снижения LDL холестерина поглощения, были использованы в качестве позитивного элемента управления. Изображения взяты при 10-кратном. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 . Снижение ЛПНП приток в эндотелиальных клетках человека коронарной артерии (HCAECs) агентом поглощения понижая ЛНП, Dynasore. Представитель изображения фазы и красный объектов для HCAECs, изображенные на 0,33 h (левой панели) и конечную точку 4.33 h (правой панели) показывают состояние Исправен клеток. 40 мкм Dynasore, известный для снижения LDL-холестерина поглощения, был использован в качестве позитивного управления (C). Изображения были взяты при 10-кратном. Шкалы бар = 100 µm. данные являются mean±SEM. N = 6 скважин/группа. Данные являются представитель 2 или 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: определение параметров обработки. Эти параметры являются специфическими для системы анализа, используемые в настоящем Протоколе. Параметры следует настроить для анализа красная область красного канала и область ячейки в фазе канала. Настройки параметров для HepG2, HK2, представлены HCAE клеточных линий.
Таблица 2: процентное изменение в ЛПНП приток в HepG2, HK2 и HCAE клетки лечат Dynasore, rPCSK9 или СИМВАСТАТИН на 4,3 ч. (A) HepG2 клетки, клетки (B) HK2, (C) HCAE клетки и клетки HepG2 (D).
Discussion
В текущем протоколе мы демонстрируем использования изображений живой клетки как новый и более эффективный метод для измерения реального времени ЛПНП поглощение время курс в различных линий клеток человека. Клетки человека рак печени (HepG2) обычно используются в исследованиях, скрининг гиполипидемической терапии21,,2223,24,25,26, , 39-40. Поэтому мы выбрали этот тип ячейки для тестирования возможностей визуализации системы живой клетки для ЛПНП приток исследований. Наши результаты показывают, что HepG2 клетки, совместимы с этой новой техники и результат в сигмовидной кишки, как кривая, указывающее непрерывное поглощение ЛПНП на время приток assay до 4,33 h как на финальную конечную точку (рисунок 2A и Рисунок 3 ).
Холестерин гомеостаза играет важную роль в патофизиологии различных нефропатии. Действительно накопление холестерина в почечной ткани является крупный вклад почечной фиброз, приводит к хронической болезнью почек и основных патологии в различных нефропатии28,,2930,31. Следовательно мы изучили наш метод в клетках человека эпителия почек (HK2) как популярные и надежные клеточная линия, используемых в области нефрологии. Наши данные также поддерживает возможности живой клетки тепловизионные системы для измерения ЛПНП приток в HK2 клетках. Как показано на рисунке 2B, HK2 клетки take up ЛПНП линейно на всем протяжении приток исследования (4 часа).
Ввиду важности метаболизм холестерина в развитии и прогрессировании атеросклероза32,,3341, ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний, которые в свою очередь является убийцей номер один во всем мире 42, мы направлены для проверки нашего метода в типе атеросклероз соответствующие ячейки. Мы использовали человека коронарных артерий эндотелиальных клеток (HCAECs), поскольку они являются одним из первых типов клеток подвергаться воздействию холестерина оскорбление в просвет коронарной артерии пациента атеросклероза. Наши данные, показан на рис. 2C указывает, что этот метод приток ЛПНП также работает эффективно с HCAECs. Полученный график является кривой сигмовидной кишки как похож на что из HepG2 клеток.
Чтобы проверить действительность и чувствительности этот повышение ЛПНП приток assay для проверки соединений, влияющих на LDL-холестерина поглощения, мы использовали три управления, ЛПНП снижение поглощения агентов Dynasore и rPCSK9 и ЛПНП приток активатор симвастатин. Здесь, мы рассматривали выше упомянутых клеточных линий (HepG2, HK2 и HCAECs) с оптимизированной концентрации Dynasore или rPCSK9 до приток assay. Наши результаты показали, что все три испытания клеточных линий ответил на лечения с значительного сокращения притока ЛПНП над 4-часовой курс (рис. 2). К примеру, 4.33 h в последний момент, лечение с Dynasore на 40 мкм значительно сократить приток ЛПНП в HepG2 клетки, клетки HK2 и HCAECs на 53%, 68% и 54%, соответственно (p < 0,0001; Рисунок 2 A-C и Таблица 2A-C). Кроме того, rPCSK9 на 10 мкг/мл вызвало заметное сокращение 55% ЛПНП приток в HK2 клетках (p < 0,0001; Рисунок 2 B и Таблица 2B). Кроме того наши исследования показали, что лечение HepG2 клетки с СИМВАСТАТИН привели к заметному увеличению поглощения ЛПНП (рис. 3), поддерживая чувствительность этого метода для обнаружения значительных изменений в ЛПНП приток. Исследования лечения с rPCSK9 в HepG2 и HCAEC клетки не включаются в этот протокол, как rPCSK9 используется в качестве дополнительного контроля лечения с документально результаты, но дорого купить в небольших количествах. Поэтому rPCSK9 использовался только для проверки этот протокол в HK2 клетках.
Живой клетки визуализации анализа, а также функциональные и своевременного измерение притока ЛПНП, допускается для непрерывного мониторинга здоровья и морфологию клеток. Это преимущество может эффективно обнаруживать потенциальные цитотоксичность применяемых соединений, что делает этот метод идеальной техникой одновременно мониторинга фармакологической активности и цитотоксичность. Цифры 5-7 иллюстрируют представитель образы трех проверенных клеточных линий на финальную конечную точку (4.33 h) как визуальную ссылку для эффекта лечения на чистый приток ЛПНП, а также показывает здорового морфологию клеток после испытания лечение. Мы рекомендуем визуальный осмотр всех изображений из каждой скважины заверить вересковый морфологию клеток на время исследования. Например, в данных не отображаются, когда изображения HepG2 клеток лечение с 80 мкм Dynasore были проверены, мы наблюдали признаки клеток отряд, как по краям клетки представляется, отрывая пластину, предлагая мобильный отряд в более высоких концентрациях Dynasore. Кроме того высокие концентрации препарата СИМВАСТАТИН (3-10 мкм), также привело к указанием измененных морфология индуцированного апоптоза как сообщалось на высоких дозах статины45. Этот протокол был использован для выполнения титрование Dynasore лечения на 20-80 мкм, и симвастатин в концентрации 0,5-10 мкм, после чего ячейка изображения были использованы для анализа здоровье клеток и определения потенциальных ctotoxicity лечения на различные концентрации. Результаты предложили использовать 40 мкм для Dyansore и 1 мкм для СИМВАСТАТИН как оптимальной концентрации.
И наконец мы предлагаем, выполняя исследования титрования плотность клеток, если другая линия клетки должна быть протестированы с помощью этого метода для того, чтобы определить оптимальное ячейки номер в хорошо для получения согласованных результатов. Наши клетки плотность оптимизации исследование показало, что 10 000 клеток/хорошо в пластине 24-ну привести к последовательной ЛПНП приток результаты для HK2 и HCAE клеток. Важно отметить, что этот assay приток ЛПНП, с использованием живой клетки изображений системы, монослой клеток не притока, равномерно распределены на скважинах желательно как скопления клеток может привести к ошибкам в окончательный нормализованных значений приток ЛПНП. Причина этого заключается в том, что для нормализации данных приток, области объекта фаза используется как мера плотность клеток и этот параметр может пострадать при образуются скопления клеток. Мы наблюдали, что HepG2 клетки имеют тенденцию к форме сгустки когда осеменены на плотности выше 5000 клеток/хорошо вызывая несовместимым приток результаты; Таким образом мы использовали 5000 клетки в колодец в пластине 24-Ну как оптимальной плотности для HepG2 клеток.
Коллективно наш метод предоставляет платформу средняя высокая пропускная способность для скрининга фармакологической активности и цитотоксичность соединений, регулирующий приток ЛПНП одновременно. Этот метод может быть легко адаптирована для использования с другими дневно меченых лиганды, которые ввести лизосомальных отсек для оценки поглощения лиганд в режиме реального времени. Хотя этот протокол предлагает спецификации для InCucyte живут визуализации и анализа системы, протокол может быть адаптирован для альтернативных систем тепловидения, например целломике.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана следующие гранты ЛАГ: Национальный институт здравоохранения (R56HL132209 и 1R01HL140468) и Майами сердца исследовательского института. KY является получателем американского сердца ассоциации лектор стипендий (18PRE33960070). HepG2 клетки были любезно предоставленных д-р Томас Эммануэль, Университет Майами-Миллер школа медицины46,47,48.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
| HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
| MEM | Sigma | M0325 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Sigma | G7513 | |
| FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
| Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
| Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
| Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
| 24 well plate | Falcon | 353226 | |
| 40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
| Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
| PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |
References
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G.
- Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
- Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
- Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
- Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
- Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
- Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
- Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
- Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
- Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
- Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
- Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
- Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
- Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
- Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
- Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
- Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
- Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
- Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
- McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
- Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
- Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
- Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
- Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
- Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
- Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
- Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M.
- Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
- Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
- Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
- Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
- Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
- Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
- Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
- Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
- Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).
