Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella
Summary
In dit artikel beschrijven we de protocollen van eiwit expressie, zuivering, kristallisatie en structuur vastberadenheid van het domein van de N-terminal van de ryanodine receptor van de koolmot (Plutella xylostella).
Abstract
Ontwikkeling van krachtige en efficiënte insecticiden gericht op insecten ryanodine receptoren (RyRs) is van groot belang op het gebied van landbouw ongediertebestrijding. Tot op heden verschillende diamide insecticiden gericht op pest die ryrs hebben op de markt zijn gebracht, die genereren jaarlijkse inkomsten van 2 miljard VS‑dollar. Maar begrip van het werkingsmechanisme van RyR-targeting insecticiden is beperkt door het gebrek aan structurele informatie met betrekking tot insect RyR. Dit beperkt op zijn beurt inzicht in de ontwikkeling van insecticide resistentie in ongedierte. De koolmot (DBM) is een vernietigende plaag vernietigen kruisbloemige gewassen wereldwijd, die is ook gemeld om te laten zien van de weerstand tegen diamide insecticiden. Het is daarom van groot praktisch belang om roman insecticiden gericht op de DBM RyR, vooral gericht op een regio verschilt van de traditionele diamide bindende site. Hier presenteren we een protocol structureel karakteriseren het N-terminaal gebied van RyR van DBM. De kristalstructuur x-ray werd opgelost door moleculaire vervanging bij een resolutie van 2,84 Å, die toont een bèta-klaverblad opvouwbare motief en een begeleidende alpha-helix. Dit protocol kan worden aangepast voor de expressie, zuivering en structurele karakterisering van andere domeinen of eiwitten in het algemeen.
Introduction
Ryanodine receptoren (RyRs) zijn specifieke ionenkanalen, die de permeatie van Ca2 + ionen in de membranen van sarcoplasmic reticulum (SR) in spiercellen bemiddelen. Daarom spelen ze een belangrijke rol in de excitatie-contractie koppeling proces. In zijn functionele vorm, assembleert RyR als een homo-tetrameer met een molecuulmassa van > 2 MDa, met elke subeenheid bestaande uit ~ 5000 aminozuurresidu’s. Bij zoogdieren, er zijn drie isoforms: skeletspieren type RyR1 -, RyR2 – type van de hartspier en RyR3-overal uitgedrukt in verschillende weefsels en1.
Bij insecten is er slechts één soort RyR, die wordt uitgedrukt in spier- en zenuwstelsel weefsel2. Insect RyR is meer vergelijkbaar met zoogdieren RyR2 met de identiteit van een reeks van ongeveer 47%3. Diamide insecticiden gericht op RyR van Lepidoptera en kevers zijn ontwikkeld en verkocht door grote bedrijven zoals Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) en Syngenta (cyantraniliprole). Sinds de relatief recente lancering, diamide insecticiden uitgegroeid tot een van de snelst groeiende klasse van insecticiden. Op dit moment hebben de verkoop van deze drie insecticiden jaarlijks 2 miljard Amerikaanse dollars met een groeitempo op jaarbasis van meer dan 50% overschreden sinds 2009 (Agranova).
Recente studies hebben melding gemaakt van resistentie bij insecten na een paar generaties van gebruik van deze insecticiden4,5,6,7,8. De weerstand mutaties in de transmembrane domein van RyRs vanaf Plutella xylostella (G4946E, I4790M), de koolmot (DBM) en de overeenkomende posities in tomaat trechtervallen, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) blijkt dat de regio zou kunnen zijn die betrokken zijn bij diamide insecticide bindend, aangezien deze regio is bekend om zijn cruciaal voor het gating van het kanaal4,8,9. Ondanks uitgebreid onderzoek op dit gebied blijven de exacte moleculaire mechanismen van diamide insecticiden elusive. Bovendien is het onduidelijk of de weerstand mutaties van invloed zijn op de interacties met diamides direct of allosterically.
Eerdere studies hebben melding gemaakt van de structuur van verschillende RyR domeinen van soorten zoogdieren en de structuur van full-length zoogdieren RyR1 en RyR2 door middel van röntgendiffractie en cryo-elektronenmicroscopie, respectievelijk10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Maar tot nu toe geen structuur van insect RyR heeft gemeld, dat verbiedt ons begrip van de moleculaire fijne kneepjes van de receptor functie en de moleculaire mechanismen van insecticide actie en ontwikkeling van insecticide-resistentie.
In dit manuscript presenteren wij een veralgemeende protocol voor de structurele karakterisering van N-terminale β-klaverblad domein van ryanodine receptor van de koolmot, een vernietigende plaag kruisbloemige gewassen wereldwijd22infecteren. De constructie is ontworpen volgens de gepubliceerde konijn RyR1 NTD crystal structuren23,24en de cryo-EM structurele modellen16,17,18,19, 20 , 21. Dit is de eerste met een hoge resolutie structuur gerapporteerd voor insect RyR, die onthult het mechanisme voor het kanaal gating en een belangrijke sjabloon voorziet in de ontwikkeling van soortspecifieke insecticiden gebruik structuur gebaseerde drug design. Voor de opheldering van de structuur werkzaam wij middel van röntgendiffractie, die wordt beschouwd als de ‘gouden standaard’ voor eiwit structuurbepaling bij in de buurt van atomaire resolutie. Hoewel de kristallisatie proces onvoorspelbaar en arbeidsintensief is, helpt dit stapsgewijze protocol onderzoekers express, zuiveren en karakteriseren van andere domeinen van insect RyR of elke andere eiwitten in het algemeen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we de procedure om te recombinantly express, zuiveren, kristalliseren en bepalen de structuur van de DBM RyR NTD. Voor de kristallisatie is een cruciale eis te verkrijgen van eiwitten met hoge oplosbaarheid, zuiverheid en homogeniteit. In ons protocol, we gekozen voor het huisdier-28a-HMT vector gebruiken omdat het bevat een hexahistidine tag en MBP tag, die beide kunnen worden gebruikt voor de zuivering te verkrijgen van een hogere zuiverheid van de vouw. Bovendien, de MBP Label aids in de opl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door: nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nationale aard Science Foundation van China (31320103922, 31230061) en Project van nationale basis (973) onderzoeksprogramma van China (2015CB856500, 2015CB856504). We zijn dankbaar voor het personeel op de beamline BL17U1 in Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
Riferimenti
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
- Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
- Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
- Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
- Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
- Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
- Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
- Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
- Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
- Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
- Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
- Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
- Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
- Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
- Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
- Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
- Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
- Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).
