Summary
هنا يمكننا وصف أسلوب فوتوبليتشينج للحد من أوتوفلوريسسينسي من البكتيريا الزرقاء. بعد فوتوبليتشينج، يستخدم الميكروسكوب التعمير البصرية العشوائية للحصول على صور ثلاثية الأبعاد فائقة القرار من الحلبة فتسز سيانوباكتيريال.
Abstract
مجهرية فائقة القرار قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة التفاعلات بين البروتينات وهياكل سوبسيلولار في العديد من الكائنات الحية. في الكائنات الحية التمثيل الضوئي، بيد القرار الأفقي لتصوير فائقة القرار هو فقط 100 ~ شمال البحر الأبيض المتوسط. انخفاض القرار يرجع أساسا إلى خلفية أوتوفلوريسسينسي عالية من التمثيل الضوئي الخلايا الناجمة عن أشعة الليزر عالية الكثافة المطلوبة لتصوير فائقة القرار، مثل إعادة الإعمار البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة). هنا، يمكننا وصف ساعد فوتوبليتشينج عاصفة أسلوب الذي تم تطويره مؤخرا للتصوير بيكوسيانوباكتيريوم البحرية بروتشلوروكوككوس. بعد فوتوبليتشينج، أوتوفلوريسسينسي من بروتشلوروكوككوس يتم تقليل فعالية حتى يمكن تنفيذ تلك العاصفة بدقة أفقية ~ 10 نانومتر. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن اكتساب المنظمة في فيفو ثلاثية الأبعاد (3-D) من البروتين فتسز وتميز أربعة مورفولوجيس عصابة فتسز مختلفة خلال دورة الخلية بروتشلوروكوككوس. ويمكن اعتماد الأسلوب يصف لنا هنا لتصوير القرار فائقة للكائنات الحية الأخرى التمثيل الضوئي.
Introduction
ميكروسكوبيس القرار فائقة يمكن كسر الحد حيود الضوء وتوفير الصور ضمن قرارات حيود الفرعية (< 200 nm). قد استخدمت على نطاق واسع في العديد من الكائنات الحية لدراسة البروتين التعريب والهياكل سوبسيلولار. الرئيسية فائقة القرار تشمل أساليب الفحص المجهري منظم إضاءة مجهرية (SIM)، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED) والعاصفة فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل). الآليات والتطبيقات هذه القرار فائقة المجاهر وقد استعرضت في أماكن أخرى1،2.
العاصفة يمكن التوصل إلى قرار يصل إلى 10 نانومتر بالفصل المكاني3،4. للعاصفة، يتم تنشيط جزيء واحد فقط داخل منطقة حيود محدودة ("في") ويتم الاحتفاظ بباقي الجزيئات المعطل ("إيقاف"). بتراكم للتبديل السريع على--والخروج من الجزيئات واحدة، يمكن أن تكون صورة "حيود غير محدود" ولدت3. ومن ناحية أخرى، قابلة للتطبيق في العاصفة، والسماح بترقية سهلة من الفحص المجهري الفلورية العادية للفحص المجهري عالية الدقة5،6أنواع كثيرة من الأصباغ العضوية والبروتينات الفلورية.
العاصفة لم تطبق على نطاق واسع في الخلايا التمثيل الضوئي، مثل البكتيريا، الطحالب، والخلايا النباتية مع المعايشة7،8، وهو يرجع ذلك إلى حقيقة أن العاصفة يتطلب كثافة الليزر عالية إلى فوتوسويتشينج بالسيارة. الليزر عالية الكثافة ظالم يثير الخلفية أوتوفلوريسسينسي قوية في خلايا التمثيل الضوئي ويتداخل مع التعريب جزيء واحد في تصوير العاصفة. من أجل استخدام العاصفة إلى التحقيق فيها الهياكل سوبسيلولار أو تفاعلات البروتين في خلايا التمثيل الضوئي، قمنا بتطوير بروتوكول فوتوبليتشينج لإخماد إشارات أوتوفلوريسسينسي الخلفية9. في إجراءات روتينية المصبوغة إيمونوفلوريسسينت، تتعرض العينات للضوء الأبيض كثافة عالية خلال الخطوة الحظر، مما يقلل من أوتوفلوريسسينسي الخلايا التمثيل الضوئي لتلبية المتطلبات للعاصفة. وهكذا، هذا البروتوكول يجعلها ممكنة التحقيق في الكائنات الحية المصطبغة بالعاصفة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام العاصفة بصورة منظمة عصابة فتسز في بيكوسيانوباكتيريوم أحادي الخلية بروتشلوروكوككوس. FtsZ هو بروتين cytoskeletal مصانة عالية مثل tubulin الذي بوليميريزيس لتشكيل هيكل الدائري (الطوق Z) حول محيط الخلية10 وهو ضروري ل انقسام الخلية11. الحفاظ على بروتشلوروكوككوس الخلايا فوتوبليتشيد الأولى للحد من الخلفية أوتوفلوريسسينت وإيمونوستينيد مع جسم FtsZ مكافحة الأولية، وثم جسم مفتش (H + L) المضادة أرنب ثانوية مترافق مع فلوروفوري (مثلاً ، أليكسا فلور 750). في نهاية المطاف، يتم استخدام العاصفة لمراقبة المنظمات خاتم فتسز مفصلة في بروتشلوروكوككوس خلال مراحل مختلفة من دورة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-عينة من الإعداد والتثبيت
- تطعيم 1 مل من أكسينيك MED4 بروتشلوروكوككوس إلى 5 مل من Pro99 المستندة إلى مياه البحر المتوسط12. تنمو الثقافات بروتشلوروكوككوس في 23 درجة مئوية تحت الضوء مع كثافة 35 µmol الفوتونات/م2س. وبعد خمسة أيام، وجمع 1 مل ثقافة في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: خمسة أيام بعد التطعيم، MED4 بروتشلوروكوككوس سوف تصل إلى مرحلة سجل الراحل، مع حوالي 108 خلية/مل، ومناسبة لتصوير العاصفة. - إضافة 100 ميليلتر من فورمالدهايد طازج من 25% بارافورمالدهيد (PFA) (w/v) و 2 ميليلتر من 50 ٪ glutaraldehyde في أنبوب 1.5 مل لإصلاح الثقافة. احتضان العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: العينة أبقى في الظلام للتثبيت لأن جلوتارالديهيدي هو الضوء حساسة. - تدور أسفل العينة في 13,500 س ز 1 دقيقة؛ ثم إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من Pro99 متوسطة12. تخزين العينة في 4 درجات مئوية حتى إيمونوستينينج.
2-precoating ساترة مع الخرز البوليسترين
ملاحظة: تعتبر الخرز البوليسترين كعلامة الاعتماد لتصحيح الانحراف.
- دوامة الأصلي فيال من الخرز البوليسترين وإعداد إضعاف 1:20,000 مع الإيثانول 50% كعامل الملاط.
- بدوره على صفيحة وتعيين درجة الحرارة إلى 120 درجة مئوية، ووضع كوفيرسليبس على صفيحة.
- تحميل 100 ميليلتر من الملاط العامل على كل ساترة. احتضان ساترة على لوحة الساخن لمدة 10 دقائق، وبعد ذلك، نقل بعناية في كوفيرسليبس إلى أطباق بتري للتخزين في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب أن تواجه الجانب مع الخرز المرتبطة به، ويجب أن يتم إرفاق الخلايا على نفس الجانب. معطلة في كوفيرسليبس الخرز واستخدامها لتصحيح العينة الانجراف في الوقت الحقيقي أثناء تصوير العاصفة. بعد شل حركة الخرز، لا يمكن أن يكون ملتهب في كوفيرسليبس.
3-طلاء بولي-L-يسين على ساترة المغلفة بحبه
ملاحظة: يتم هذا للتثبيت الخلايا سيانوباكتيريال.
- إضافة 100 ميليلتر من بولي-L-يسين (1 ملغ/مل) إلى مركز ساترة مع الجانب المغلفة بحبه مواجها لأعلى. السماح لها الجلوس لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام ماصة عناية اسباير فاتحة بولي-L-يسين ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل. حفظ بولي-L-يسين في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها.
- شطف ساترة مع 10 مل مياه التي تمت تصفيتها الترا في طبق بتري 60 ملم وثم بإيجاز الجاف ساترة على منشفة ورقية.
- تخزين ساترة في طبق بتري (100 ملم) للاستخدام في وقت لاحق. لمنع إلحاق ساترة إلى الطبق، خط طبق بيتري مع طبقة من بارافيلم.
ملاحظة: يمكن تخزين ساترة، بريكواتيد مع الخرز وبولي-L-يسين، في درجة حرارة الغرفة على الأقل نصف عام. لذلك، إعداد مجموعة كوفيرسليبس مقدما ينصح بشدة.
4-تجميد الخلايا على ساترة
- نقل ساترة بريكواتيد إلى طبق بتري جديد مع بارافيلم في الجزء السفلي، وسوف يشار إليها باسم الطبق المصبوغة من الآن فصاعدا. تحميل 100 ميليلتر من نموذج ثابت على ساترة والسماح لها الجلوس مدة 30 دقيقة للسماح لمرفق خلية.
- نقل ساترة إلى بئر للوحة 12-جيدا، وسوف يشار إليها باسم الطبق الغسيل من الآن فصاعدا. أضف 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4، 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 مم بوكل، درجة الحموضة 7.4) إلى البئر ليغسل ساترة. إزالة المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني وإضافة المخزن مؤقت برنامج تلفزيوني جديد يغسل ساترة مرة أخرى.
5-بيرميبيليزيشن خلايا سيانوباكتيريال
- قم بإزالة برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت باستخدام ماصة. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن الطازجة إلى البئر طبق الغسيل، التي تحتوي على 0.05% غير الأيونية المنظفات 100 (v/v)، 10 مم يدتا، 10 مم تريس (pH 8.0)، و 0.2 مغ/مل ليسوزيمي.
- احتضان طبق الغسيل في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم، قم بإزالة المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني ووضع طبق الغسيل على شاكر الذي يهز الطبق الغسل بلطف لإزالة الحد الأدنى 5 المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 3 x ليغسل ساترة.
6-فوتوبليتشينج للكلوروفيل أصباغ في خطوة حظر
- نقل ساترة للطبق المصبوغة. إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للحظر، الذي يحتوي على 0.2% (v/v) المنظفات غير الأيونية-100 ومصل الماعز 3% (v/v)، على رأس ساترة.
- مكان كله تلطيخ لوحة على الجليد ونقله تحت مصدر ضوء زينون فوتوبليتشينج لمدة 60 دقيقة على الأقل، بكثافة ضوء في 1,800 µmol الفوتونات/م2·s.
- بعد فوتوبليتشينج وحظر، بعناية إزالة المخزن المؤقت حظر قبل أدسوربينج أنه مع حافة منشفة ورقية.
ملاحظة: كثافة الضوء زينون عالية جداً لدرجة أن زوج من النظارات الشمسية المناسبة ضروري لحماية العين. وفي الوقت نفسه، التفاف لوحة باستخدام رقائق الألومنيوم لتجنب تسرب الضوء، والتي قد تتسبب في تلف العين ومصدر الضوء. تحقق ساترة كل 15 دقيقة للتأكد من أن ساترة لا تزال رطبة. إذا كانت ساترة الجافة، إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر.
7-جسم ملزمة
- حل مضاداتAnabaena فتسز جسم في 200 ميليلتر من الماء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- تمييع 1 ميليلتر من الأجسام المضادة فتسز المضادة إلى 99 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر. إضافة 50 ميليلتر من جسم الابتدائي المخفف ساترة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- نقل ساترة للطبق الغسيل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني ووضع طبق الغسيل على هزة. بلطف يهز الطبق الغسيل لأدنى 5 تكرار هذه الخطوة 3 x ليغسل ساترة.
- نقل ساترة للطبق المصبوغة. تمييع 1 ميليلتر من جسم الثانوية إلى 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر. إضافة 50 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف على ساترة واحتضان أنه لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- نقل ساترة للطبق الغسيل. يغسل مع 1 مل من المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني حول شاكر. بلطف يهز الطبق الغسيل لأدنى 5 التفاف الغسيل الطبق بورق الألومنيوم لجعلها واقية من الضوء. كرر هذه الخطوة 3 x.
- إضافة 500 ميليلتر من فورمالدهايد طازج من 4% بارافورمالدهيد (PFA) (w/v) إلى البئر. احتضان ساترة لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الفورمالدهايد وكرر الخطوة الغسيل 3 x.
- تخزين ساترة في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية في الظلام حتى التصوير.
8-إعداد العاصفة التصوير المخزن المؤقت
- إعداد 1 مل من التصوير المخزن المؤقت وفقا الجدول 1، مباشرة قبل تصوير العاصفة.
ملاحظة: حسب العمر الافتراضي للمخزن المؤقت التصوير حوالي 2 ح، إعدادها طازجة، الحق قبل الاستخدام. تجنب فورتيكسينج بعد إضافة الغلوكوز أوكسيديز والكاتالاز.
تنبيه: فيولوجين الميثيل مادة سامة. يرجى التعامل معها بعناية خاصة. سيكلوكتاتيترايني تصنف على أنها مادة مسرطنة القط. 1 الكيميائية. الرجاء تجنب استنشاق والجلد الاتصال وقم بحل سيكلوكتاتيترايني المخزون والمخزن المؤقت للتصوير في غطاء كيميائية.
9-الصورة الحصول على بيانات العاصفة
- تحميل ساترة في قاعة تحميل (الشكل 1). تحميل المخزن المؤقت التصوير الطازجة بلطف إلى غرفة لتجنب الغسيل خارج الخلايا سيانوباكتيريال. مكان ساترة مستطيلة على رأس المخزن المؤقت التصوير لمنع فعلها مع الأكسجين في الهواء. تجنب فقاعات الهواء الملائمة تحت ساترة.
- قم بتشغيل الكاميرا والضوء LED والليزر. عاصفة البرمجيات المفتوحة للحصول على الصور وتحديد موقف centroid والانجراف تصحيح13عينة.
- إضافة نصف قطره من النفط الغمر أعلى العدسة. تحميل الدائرة وتأكد من العدسة الهدف يجعل الاتصال مع ساترة.
- فحص الإشارات مع ليزر 750 نانومتر.
ملاحظة: دائماً تضمين عنصر تحكم سلبية ثانية تلطيخ جسم-ناقص التأكد من أن يتناقص في أوتوفلوريسسينسي. - تحديد منطقة نموذج يحتوي على خلايا وعلامات الاعتماد. بدء تشغيل البرنامج الخاص بنموذج الانجراف التصحيح.
ملاحظة: بشكل عام، منطقة نموذج مثالي يحتوي على خلايا 10-30. وفي الوقت نفسه، ينبغي فصل الخلايا جيدا لتجنب أي تداخل الخلايا. - الحصول على صورة واسع المجال واحدة كمرجع، ومع تكاثر إلكترون الكاميرا (م) الحصول على 300 ووقت تعرض 30 مللي ثانية (الشكل 2A).
- زيادة كثافة الليزر الإثارة 750 نانومتر إلى سلطة أعلى، حوالي 4.5 كيلو واط/سم2. مرة واحدة فلوروفوريس قد انتقلت إلى نمط وامض متفرق، الحصول على صورة فائقة الدقة واحد بجمع الإطارات 10,000 في 33 هرتز (الشكل 2).
ملاحظة: إذا فلوروفوريس ليست معزولة، انتظر لبضع دقائق حتى يتم تبديل fluorophores أكثر للدولة الظلام وجزيئات مفردة معزولة تومض تسلسلياً. عدد الإطارات التي تم وصفها هنا يناسب العينة، ويحتاج إلى أن يكون الأمثل للهياكل الأخرى المستهدفة.
10-إعادة بناء صور فائقة الدقة من البيانات الخام
- استخدام البرنامج المساعد ودعا كويكبالم (جدول المواد)14 في إيماجيج لإعادة بناء صورة دقة فائقة لون ثلاثي الأبعاد.
ملاحظة: أولى لوني صورة (الشكل 2) جنبا إلى جنب مع شريط مقياس ترميز سوف يظهر (الشكل 2). ويمثل اللون عمق محور ع. - تثبت على هيكل ثلاثي الأبعاد في بناء فيديو، كومة من القرار فائقة الصور مع محور ع مقطوع كل 10 نانومتر باستخدام كويكبالم14. ضبط سطوع المداخن وتكرار المكدس للخلية الهدف واحد. استخدام البرنامج المساعد دعا عارض ثلاثي الأبعاد (جدول المواد)15 في إيماجيج لتوليد صورة ثلاثية الأبعاد للخلية. سجل تناوب هيكل ثلاثي الأبعاد لأغراض العرض التوضيحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العاصفة يحقق تصوير فائقة القرار بتفعيل الفردية فوتوسويتشابل فلوروفوريس ستوتشاستيكالي. يتم تسجيل الموقع من كل فلوروفوري والتي شيدت صورة فائقة الدقة ثم استناداً إلى هذه المواقع4. ولذلك، المهم دقة موقع فلوروفوري لإعادة بناء صورة فائقة القرار. أطياف الامتصاص من بروتشلوروكوككوس الذروة في 447 نانومتر و 680 نانومتر،وبروتشلوروكوككوس له امتصاص الحد أدنى عند أطوال موجية فوق 700 نانومتر16. ومع ذلك، تنبعث الخلايا MED4 بروتشلوروكوككوس لا يزال أوتوفلوريسسينسي عالية عندما تتعرض لكثافة عالية للغاية من 750 نانومتر الليزر (الشكل 3 أ)، وهو مطلوب لتصوير العاصفة. وهكذا، الخلفية أوتوفلوريسسينسي عالية من الخلايا بروتشلوروكوككوس بشدة يتداخل مع تصوير القرار فائقة.
من أجل الاستفادة من العاصفة للتحقيق مع منظمات البروتين في بروتشلوروكوككوس، قمنا بتطوير أسلوب فوتوبليتشينج. بعد التعرض لضوء أبيض من كثافة عالية لمدة 30 دقيقة، انخفض أوتوفلوريسسينسي بروتشلوروكوككوس MED4 الخلايا (الشكل 3B)، على الرغم من أن لا يزال تم الكشف عن عدة خلايا مع أوتوفلوريسسينسي. ونحن كذلك ممدود الوقت فوتوبليتشينج إلى 60 دقيقة ووجدت أن غالبية الخلايا فقدت بهم أوتوفلوريسسينسي (الشكل 3). تشير هذه النتائج إلى أن الأسلوب فوتوبليتشينج وضعنا هنا يمكن أن تقلل إلى حد كبير أوتوفلوريسسينسي في التمثيل الضوئي في الكائنات الحية.
وبعد فوتوبليتشينج، كنا قادرين على استخدام العاصفة إلى تصور انقسام الخلية البروتين فتسز في بروتشلوروكوككوس MED4 الخلايا. سيانوباكتيريوم بروتشلوروكوككوس هو أصغر والحي التمثيل الضوئي الأكثر وفرة في الأرض17. القطر من خلية بروتشلوروكوككوس هو فقط 500-700 نانومتر18. مع حجم خلية صغيرة، من المستحيل تصور المنظمة حلقة فتسز في الخلايا بروتشلوروكوككوس باستخدام الفحص المجهري التقليدي واسع المجال الفلورية (الشكل 2A). غير أن العاصفة لديها من قرار مكانية 9.6 نانومتر في نانومتر س ص-الطائرة و 41.6 في محور ع. استخدام العاصفة، استطعنا أن تكشف مورفولوجيا مفصلة من الحلبة فتسز في بروتشلوروكوككوس (أرقام 2B و 4). بتدوير الصور العاصفة ثلاثي الأبعاد، وقد حددنا أربعة أنواع مختلفة من فتسز عصابة مورفولوجيس: مجموعات (الشكل 4A، فيلم S1)، وحلقة ناقصة (الشكل 4 باء، S2 الفيلم)، وحلقة كاملة (الشكل 4 ج، فيلم S3)، ومضاعفة الخواتم (الشكل 4 د، فيلم S4). ولوحظت الثغرات في حلقات فتسز كاملة من بروتشلوروكوككوس (الشكل 4، فيلم S3)، التي مماثلة لتلك الموجودة في كريسينتوس كاولوباكتير19. هذه الأنواع الأربعة من فتسز عصابة مورفولوجيس وأظهرت عملية الجمعية حلقة فتسز أثناء دورة الخلية بروتشلوروكوككوس، وساعدتنا هذه الدراسة فهم دور الطوق فتسز أثناء انقسام الخلية بروتشلوروكوككوس 9.
رقم 1: مكونات الدائرة تحميل، والدائرة المجمعة مع المخزن المؤقت كوفيرسليبس وتصوير لتصوير العاصفة. ووضع ساترة مع العينة على أخدود الجزء السفلي أولاً. ثم كان بعناية مشدود الجزء العلوي إلى الجزء السفلي. أضيف في قاعة تحميل المخزن المؤقت التصوير وثم بعناية مغطاة ساترة مربعة. وينبغي تجنب فقاعات إلى أدنى حد من أي حركة قد تؤثر على دقة القياس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: تمثيلي واسع المجال والعاصفة ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد لون الصور عاصفة من فتسز في MED4 بروتشلوروكوككوس . وقد أخذت الصور من نفس الحقل للعرض باستخدام الميكروسكوب واسع المجال (A) العادية والعاصفة 2-د (ب) (ج) لون ثلاثي الأبعاد العاصفة. الألوان في لوحة ج تشير إلى عمق الفلورسنت إشارات على محور ع. تشير الأرقام في لوحة ج إلى الخلايا ذات الاهتمام. أشرطة مقياس = 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فوتوبليتشينج MED4 بروتشلوروكوككوس . ثابت MED4 بروتشلوروكوككوس كانت الخلايا (A) لا فوتوبلياتشيد، أو أنهم كانوا فوتوبلياتشيد (ب) 30 دقيقة و (ج) 60 دقيقة. تم استخدامه في ضوء زينون XD-300 في شدتها من 1,800 µmol/م2·s. الخلايا كان متحمس بليزر 750 نانومتر في نفس الكثافة كما كان يستخدم لتصوير العاصفة. تم تصويرها في أوتوفلوريسسينسيس مع نفس عوامل التصفية المستخدمة في العاصفة للتأكد من وجود الحد الأدنى من أوتوفلوريسسينسي أن تؤثر العاصفة. أشرطة مقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: صور العاصفة الممثل من أربعة مورفولوجيس عصابة فتسز. أربعة مورفولوجيس عصابة فتسز مختلفة وقد لوحظت في بروتشلوروكوككوس: مجموعات (A) وعصابة (ب) كاملة وعصابة (ج) كاملة وحلقات مزدوجة (د). لنفس الخلية، عرضت صور مجهرية الفلورية (ط) واسع المجال، (ثانيا) العاصفة في س ص-الطائرة، و (ثالثا) العاصفة بعد التناوب. الأفلام ثلاثية الأبعاد المقابلة للخلايا في لوحات أ، ب، ج، ود ترد في أفلام S1 و S2 S3 S4، على التوالي. أشرطة مقياس = 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المواد الكيميائية | حل الأسهم | التركيز النهائي |
| الجلوكوز | N/A | 10% (w/v) |
| تريس-Cl (pH 8.0) | 0.5 M | 50 مم |
| حمض الأسكوربيك | 100 مم | 1 مم |
| فيولوجين الميثيل | 100 مم | 1 مم |
| سيكلوكتاتيترايني | 200 ملم | 2 مم |
| تسيب | 0.5 M | 25 مم |
| أوكسيديز الجلوكوز | 56 ملغ/مل | 0.56 ملغ/مل |
| الكاتلاز | 4 مغ/مل | 40 ميكروغرام/مل |
الجدول 1: وصفه للمخزن المؤقت للتصوير.
S1 الفيلم: لاحظت مجموعات من البروتينات فتسز في بروتشلوروكوككوس الخلايا MED4- من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
S2 الفيلم: لاحظ حلقة ناقصة من البروتينات فتسز في بروتشلوروكوككوس الخلايا MED4- من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
فيلم S3: لاحظ حلقة كاملة من البروتينات فتسز في بروتشلوروكوككوس الخلايا MED4- من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
S4 الفيلم: لاحظ حلقة مزدوجة من البروتينات فتسز في بروتشلوروكوككوس الخلايا MED4- من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن الموصوفة في هذا البروتوكول، على إجراء خفض كبير في أوتوفلوريسسينسي سيانوباكتيريوم بروتشلوروكوككوس (الشكل 3)، وبعد ذلك، إيمونوستين البروتينات في الخلايا، مما مكننا من الاستفادة من العاصفة دراسة فتسز ثلاثي الأبعاد خاتم مورفولوجيس في بروتشلوروكوككوس (الشكل 4). ويمكن اعتماد هذا البروتوكول لتصوير القرار فائقة في الكائنات الحية الأخرى التمثيل الضوئي.
الدراسات السابقة على الكائنات الحية التمثيل الضوئي تستخدم أساسا سيم لتحقيق القرار فائقة التصوير سيم لا تتطلب أجهزة ليزر كثافة عالية. ومع ذلك، هو القرار المكانية سيم نانومتر فقط 100 ~1، وأقل بكثير من أن العاصفة. في هذه الدراسة، يمكن التوصل إلى القرار المكانية لصور العاصفة 9.6 نانومتر في الطائرة xy و 41.6 شمال البحر الأبيض المتوسط في محور ع9. يسمح القرار المحسنة المقدمة من فوتوبليتشينج وتصوير العاصفة الباحثين لدراسة الكائنات الحية التمثيل الضوئي في التفاصيل لم يسبق لها مثيل.
فوتوبليتشينج قبل العاصفة هو خطوة حاسمة تمكن الباحثين لمراقبة الموقع وديناميات البروتينات في الكائنات الحية أوتوفلوريسسينت. وإلى جانب البكتيريا الزرقاء، لقد أظهرنا أن أوتوفلوريسسينسي من النباتات المزهرة التمويل أعطيت أيضا يمكن أن تطفئ بعد 60 دقيقة من فوتوبليتشينج9. فوتوبليتشينج تستخدم على نطاق واسع، على سبيل المثال لتحسين نسبة إشارة إلى الضجيج والتصور من المؤشرات الحيوية متعددة تسلسلياً20. كما أنها أثبتت أن فوتوبليتشينج قبل التصوير مفيد عند الاحتفال عينة أوتوفلوريسسينسي تحت رامان الطيفي21. ولذلك، قد يكون ممكناً لتطبيق هذا الأسلوب فوتوبليتشينج لتقليل أوتوفلوريسسينسي سائر الكائنات الحية التمثيل الضوئي، بما في ذلك الطحالب حقيقية النواة والنباتات الوعائية والكائنات التي تحتوي على بروتيورهودوبسين وباكتيريوتشلوروفيل.
التمثيل الضوئي في الكائنات الحية تحتوي على أصباغ مختلفة التي تحتوي مختلف أطياف الامتصاص؛ ولذلك، الأصباغ العضوية والبروتينات الفلورية بحاجة إلى تحديد حكمه. على سبيل المثال، في هذه الدراسة، صبغة مع موجه إثارة الحد أقصى من حوالي 750 نانومتر واستخدمت. على الرغم من أن اثنين من القنوات (750 نانومتر و 650 nm) متاح للعاصفة وترد هنا، بروتشلوروكوككوس أوتوفلوريسسينت إشارات يمكن لا يزال ملاحظة بعد التعرض تحت ليزر 650 نانومتر، حتى بعد فترة طويلة فوتوبليتشينج. وربما هذا سبب 650 نانومتر واحدة من موجات امتصاص الرئيسية بروتشلوروكوككوس. من ناحية أخرى، تتضمن بعض سينيتشوكوككوس والطحالب الحمراء phycoerythrin بهم الصباغ22، التي لديها طيف امتصاص من 488 نانومتر إلى 560 نانومتر وامتصاص الحد أدنى في شمال البحر الأبيض المتوسط 65023. ولذلك، قد يكون مجديا لاستخدام قناة 650 نانومتر بدلاً من قناة 750 نانومتر لدراسة البروتينات داخل هذه أوتوتروفس التي تحتوي على فيكوريثرين.
وباختصار، يوفر مزيج مناسب من فوتوبليتشينج والعاصفة نهج قوية لفهم المنظمة البروتين في خلايا التمثيل الضوئي بالتفصيل، التي سوف تكشف كذلك عن وظيفتها ديناميات وإمكانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون شو داييينج لها المساعدة التقنية والتعليقات على المخطوطة. ويدعم هذه الدراسة المنح المقدمة من "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (المشروع رقم 41476147) و "مجلس منح البحوث" "منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة"، الصين (المشروع رقم 689813 و 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
