بناء ورقة الطبقات الوسيطة من الخلايا الجذعية مع نظام 3D دينامية الثقافة
Summary
توفر هذه المقالة طريقة فعالة ومجدية لبناء أوراق الخلايا الجذعية متعددة الطبقات مع خاصية الخلايا الجذعية مواتية.
Abstract
العلاج بالخلايا الجذعية يظهر مبشرة بالخير مستقبلا في تجديد الجهاز المصاب والأنسجة، وقد وضعت الخلية ورقة تقنية لتحسين استبقاء خلية منخفضة وبقاء الفقراء داخل المنطقة الهدف. ومع ذلك، أثناء عملية البناء في المختبر ، إيجاد حل للحفاظ على الخلايا الجذعية بيواكتيفيتي وزيادة حجم الخلية داخل الخلية الورقة حاجة ملحة. هنا، يقدم هذا البروتوكول طريقة لبناء ورقة خلية متعددة الطبقات مع بيواكتيفيتي الخلايا الجذعية مواتية وقابلية التشغيل الأمثل. تامور الخنزيري ديسيلولاريزيد (الحزب الديمقراطي التقدمي) أعدها phospholipase طريقة ديسيلولاريزيشن2 (جيش التحرير الشعبي الصيني2) سقالة خلية ورقة، وهي معزولة الفئران نخاع العظام الخلايا الجذعية الوسيطة (بمسكس) وتوسيع كخلايا المصنف. يتكون هيكل ورقة مؤقتة الخلية متعدد الطبقات باستخدام RAD16–أنا هيدروجيل الببتيد. وأخيراً، هو مثقف الورقة خلية مع نظام التروية دينامية لتحقيق الاستقرار في هيكل ثلاثي الأبعاد (3D)، والورقة الخلية يمكن الحصول عليها بعد ثقافة 48 ساعة في المختبر. هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة ومجدية لبناء ورقة خلايا الجذعية المتعددة الطبقات، والورقة خلية يمكن تطويرها كمنتج علاج بخلايا الجذعية مواتية في المستقبل.
Introduction
وقد تم الإبلاغ عن العلاج بالخلايا الجذعية كعلاج فعال للعديد من الأمراض؛ ومع ذلك، استبقاء خلية منخفضة وبقاء الفقراء داخل المنطقة الهدف تظل القضايا الحرجة بعد حقن الخلايا الجذعية التقليدية. لحل هذه المشكلة، وضع علماء هندسة الأنسجة خلية ورقة تقنية. أعدت ورقة خلية مونولاييريد مع المصفوفة خارج الخلية سليمة أولاً باستخدام طبق ثقافة الاستجابة لدرجة الحرارة1، وأفادت به دراسات المتابعة تحسينات هامة للاحتفاظ بالخلايا الجذعية، والبقاء على قيد الحياة داخل إينفاركتيد المجال2،3. من بين الأساليب، سجلت بناء الورقة خلية متعددة الطبقات كاستراتيجية فعالة لتحسين بقاء الخلية والخلية ورقة التأثير العلاجي3،4. ومنذ ذلك الحين، عملت العلماء على تطوير أساليب التشييد ورقة خلية مختلفة بغية زيادة حجم الخلية وخاصية الخلايا الجذعية، والخاصية الميكانيكية صحائف الخلية. وحتى الآن، تم تشييد أنواع معينة من خلية ورقة ودرس في علاج احتشاء عضلة القلب5، إصابة الغضروف6، والجلد الجرح7.
بيواكتيفيتي الخلايا الجذعية قبل الزرع وأظهرت تأثير ناشئة على تجديد الأنسجة المتضررة، واستراتيجيات بناء الورقة خلية مختلفة لها تأثيرات مختلفة على الخلايا الجذعية. من ناحية، أوراق خلية المتلاقية فقط يتألف من خلايا جذعية عالية الكثافة، ومصفوفات خارج الخلية الطبيعية يمكن الحصول عليها ب أوراق خلية مونولاييريد التراص8 أو بواسطة استخدام تقنيات هندسة الأنسجة المغناطيسية9. من ناحية أخرى، طور الباحثون السقالات مختلفة توفير قوة ميكانيكية كافية ودعم الخلية النمو10،11،12، مما يسمح لخلايا الجذعية منخفضة البذر الكثافة لضمان التغذية الإمداد. على الرغم من هذه النهج، إمدادات التغذية كفاءة منخفضة داخل هيكل الخلية متعدد الطبقات ورقة زال شاغلا رئيسيا خلال عملية التشييد في المختبر . ولذلك، مطلوب على وجه السرعة نظام بناء ورقة خلية فعالة ومجدية.
ويصف هذا البروتوكول خطوات لإعداد ورقة خلية من خلايا الجذعية (MSC) مولتيلاييريدميسينكهيمال. في هذا النظام من البناء، خلية ورقة قوة ميكانيكية يتم توفيرها من قبل النيابة العامة. وبناء على هذه السقالة، هيكل الخلية 3D يمكن بسرعة بناؤها مع RAD16–أنا هيدروجيل الببتيد، ونظام التروية حيوي يستخدم للثقافة الورقة خلية متعددة الطبقات، بغية تحقيق الاستقرار في هيكل الخلية 3D ورقة وتوفير التغذية الكافية إمدادات للخلايا. باستخدام هذا النظام، تم بنجاح إعداد ورقة بمسك متعدد الطبقات وأظهرت تأثير علاجية مثلى على نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران13.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول التقارير وسيلة فعالة لبناء ورقة MSC متعدد الطبقات. يسلك هذه الورقة الخلية أمثل القوة الميكانيكية وخلية عالية الكثافة بذر بيواكتيفيتي الخلايا الجذعية مواتية. استخدام بمسكس على سبيل مثال، يتم إنشاء هيكل الخلية 3D بسرعة مع RAD16–أنا هيدروجيل الببتيد. بعد يجري المستزرعة في النظام …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (رقم المنحة 31771064)؛ العلوم والتكنولوجيا تخطيط المشروع من مقاطعة قوانغدونغ (منحة الأرقام 2013B010404030 و 2014A010105029 و 2016A020214012)؛ العلوم والتكنولوجيا تخطيط المشروع من قوانغتشو (رقم المنحة 201607010063)؛ والمرحلة الجامعية الابتكار وتنظيم برنامج تدريبي (رقم المنحة 201610559028)؛ المؤسسة الوطنية للعلوم “العلماء الشباب من الصين” (منح رقم 31800819).
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
Riferimenti
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).
- Narita, T., et al. The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure. Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).
- Matsuo, T., et al. Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction. Circulation. 128 (22), (2013).
- Alshammary, S., et al. Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction. Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).
- Chen, G. P., et al. The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).
- Cerqueira, M. T., et al. Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).
- Ishii, M., et al. Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).
- Godier-Furnemont, A. F., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Liu, Y., et al. Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction. American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).
- Arana, M., et al. Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction. Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).
- Wang, Y., et al. Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system. Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).
- Wu, Z., et al. The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).
- Degano, I. R., et al. The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation. Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).
- Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials. Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).
- Cui, X. J., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).
- Jun, I., et al. Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).
- Chen, C. H., et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).
