Строительство многослойных мезенхимальных стволовых клеток листа с системой 3D динамичной культуры
Summary
Эта статья предоставляет метод эффективно и целесообразно для построения листы многослойного стволовых клеток с свойства благоприятные стволовых клеток.
Abstract
Терапия стволовой клетки показывает многообещающее будущее в регенерации потерпевшего органов и тканей и клеток листа техника была разработана для улучшения удержания низкой клеток и бедными выживания в целевой зоне. Однако во время процесса строительства в vitro срочно необходима решение для сохранения стволовых клеток биологическую и увеличивая объем ячейки в ячейку листа. Здесь этот протокол представляет метод для построения клеток многослойного листа с благоприятным стволовых клеток биологическую и оптимальной работоспособности. Decellularized свинину перикарда (DPP) подготовлен фосфолипазы decellularization метод2 (2пла) как на эшафот ячейки листа, и изолированы и расширена в сеяный клетки костного мозга крысы мезенхимальных стволовых клеток (BMSCs). Временные многослойных клеточной структуры листа строится с помощью RAD16-я пептид гидрогеля. Наконец лист клетки культивировали с системой динамического перфузии стабилизировать структуру трехмерного (3D), и ячейку листа могут быть получены после 48-часовой культуры в пробирке. Этот протокол предоставляет метод эффективно и целесообразно для создания многослойных стволовых клеток лист и ячейку листа могут быть разработаны как продукт терапии благоприятные стволовых клеток в будущем.
Introduction
Терапия стволовой клетки было сообщено как эффективным средством лечения многих заболеваний; Однако низкий ячейки хранения и бедными выживания в целевой зоне остаются критические вопросы, после инъекции традиционные стволовых клеток. Для решения этой проблемы, ткани инженерных ученые разработали технику ячейки листа. Однослойное ячейки листа с нетронутыми внеклеточная матрица сначала был подготовлен с помощью температуры ответ культуры блюдо1, и его последующие исследования сообщили значительные улучшения сохранения стволовых клеток и выживания в infarcted Площадь2,3. Среди методов создания многослойных ячейки листа было сообщено как эффективную стратегию для улучшения выживание клетки и клетки листа терапевтический эффект3,4. С тех пор ученые работали на разработке методов строительства различных клеток листа для того, чтобы увеличить количество клеток, свойства стволовых клеток и механические свойства ячеек листов. До настоящего времени определенные типы клеток листа были построены и учился в лечении инфаркта миокарда5, хряща травмы6, и кожи раны7.
Биологическую стволовых клеток до пересадки показал возникающих влияние на регенерацию тканей потерпевшего, и стратегии строительства различных клеток листа имеют различные эффекты на стволовые клетки. С одной стороны вырожденная ячеек листов только состояла из высокой плотности стволовых клеток, и естественных внеклеточной матрицы могут быть приобретены укладки листов однослойное клетки8 или с помощью магнитных ткани, инженерной техники9. С другой стороны исследователи разработали различные леса для обеспечения адекватного механическую прочность и поддержки клеток роста10,11,12, что позволило низкий стволовых клеток, заполнение плотности для обеспечения питания питания. Однако несмотря на эти подходы, поставки низкой эффективности питания в структуре многослойных ячейки листа остается серьезной проблемой во время строительства в пробирке . Таким образом эффективно и целесообразно ячейки листа строительство системы срочно требуется.
Этот протокол описывает шаги по подготовке multilayeredmesenchymal стволовых клеток (МСК) ячейку листа. В этой конструкции системы клетки листа механическую прочность обеспечивается DPP. Основываясь на этом леску, 3D клеточной структуры может быть быстро построен с RAD16-я пептид гидрогеля и динамический перфузия системы используется для культуры многослойных ячейки листа, чтобы стабилизировать 3D клеточную структуру листа и обеспечить достаточное питание поставка для клеток. С помощью этой системы, многослойных BMSC лист был успешно подготовлен и выставлены оптимального терапевтического эффекта на инфаркт миокарда крыс модель13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий Протокол сообщает эффективный метод для построения многослойных листов MSC. Эта ячейка листа экспонатов оптимальная механическая прочность, плотность посева высокой клеток и отпорности благоприятные стволовых клеток. Использование BMSCs в качестве примера, 3D клеточной структ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (Грант номер 31771064); Наука и технологии планирования проекта провинции Гуандун (Грант номера 2013B010404030, 2014A010105029 и 2016A020214012); Наука и технологии планирования проекта Гуанчжоу (Грант номер 201607010063); и студентов инноваций и предпринимательства программа обучения (Грант номер 201610559028); Национальный научный фонд для молодых ученых Китая (предоставить номер 31800819).
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
Riferimenti
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).
- Narita, T., et al. The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure. Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).
- Matsuo, T., et al. Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction. Circulation. 128 (22), (2013).
- Alshammary, S., et al. Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction. Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).
- Chen, G. P., et al. The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).
- Cerqueira, M. T., et al. Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).
- Ishii, M., et al. Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).
- Godier-Furnemont, A. F., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Liu, Y., et al. Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction. American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).
- Arana, M., et al. Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction. Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).
- Wang, Y., et al. Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system. Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).
- Wu, Z., et al. The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).
- Degano, I. R., et al. The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation. Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).
- Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials. Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).
- Cui, X. J., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).
- Jun, I., et al. Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).
- Chen, C. H., et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).
