בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע Mesenchymal עם מערכת תרבות דינמית תלת-ממד
Summary
מאמר זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית מרובה שכבות תאי גזע סדינים עם מאפיינים חיוביים תאי גזע.
Abstract
טיפול בתאי גזע מראה מבטיח עתיד רגנרציה פצוע איברים ורקמות, הטכניקה גיליון תא פותחה כדי לשפר את השמירה תא נמוך ההישרדות המסכן בתוך אזור היעד. עם זאת, במהלך תהליך הבניה במבחנה , פתרון עבור שמירה על תאי גזע אתריים והגדלת הסכום תא בתוך הגיליון התא הוא צורך דחוף. . הנה, פרוטוקול זה מציג שיטה לבניית גיליון תא מרובה שכבות עם תאי גזע חיובית אתריים ו operability אופטימלית. קרום הלב חזירי decellularized (DPP) מוכן על ידי phospholipase שיטה decellularization2 (PLA2) כמו לגרדום גיליון תא, ואני עכברוש מח העצם בתאי גזע mesenchymal (BMSCs) הם מבודדים מורחבת של התאים הזריעה. מבנה גיליון זמני התא מרובה שכבות נבנה באמצעות RAD16-אני הידרוג פפטיד. לבסוף הגליון התא הוא תרבותי עם מערכת דינאמית זלוף לייצב את מבנה תלת-ממדי (3D), הגיליון תא יכול להיות מושגת בעקבות יישום התרבות 48 שעות במבחנה. פרוטוקול זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע, הגיליון תא ניתן לפתח כמוצר טיפול בתאי גזע חיובית בעתיד.
Introduction
טיפול בתאי גזע דווחה טיפול יעיל למחלות רבות; עם זאת, תא נמוך שימור של הישרדות המסכן בתוך אזור היעד נותרו בעיות קריטיות בעקבות הזרקת תאי גזע מסורתי. כדי לפתור בעיה זו, מדענים הנדסת רקמות פיתח את הטכניקה גיליון התא. גיליון תא monolayered עם מטריצה חוץ-תאית תקין הוכן קודם כל על-ידי שימוש של תרבות צלחת של טמפרטורה-תגובה1ודיווח על מחקרי מעקב על שיפורים משמעותיים של שימור תאי גזע של הישרדות בתוך infarcted אזור2,3. בין השיטות, בניית הגיליון תא מרובה שכבות דווחה אסטרטגיית יעיל לשיפור הישרדות תא ו-3,4האפקט הטיפולי גיליון התא. מאז, מדענים עבדו על פיתוח שיטות הבניה גיליון תא שונים על מנת להגביר את כמות התאים, תאי גזע, והמאפיין מכני הסדינים התא. עד כה, סוגים מסוימים של תא גליון נבנה ולמד בטיפול של אוטם שריר הלב5, סחוס פציעה6, ו7פצע בעור.
Bioactivity של תאי גזע לפני השתלת הראה השפעה המתעוררים על התחדשות רקמות פצוע, תאים שונים גיליון בניית אסטרטגיות יש השפעות שונות על תאי גזע. מצד אחד, confluent תא גליונות כללה רק בתאי גזע בצפיפות גבוהה, יכול לרכוש מטריצה חוץ-תאית טבעית על ידי תא monolayered הערמה גליונות8 או באמצעות טכניקות הנדסת רקמות מגנטי9. מצד שני, פיתחו פיגומים שונים כדי לספק חוזק מכני נאותה ותמיכה תא הצמיחה10,11,12, אשר אפשרה תא גזע נמוך זריעה צפיפות כדי להבטיח את התזונה לספק. עם זאת, למרות הגישות הללו אספקת תזונה יעילה נמוכה בתוך מבנה גליון תא מרובה שכבות עדיין דאגה עיקרית במהלך הבנייה במבחנה . לכן, מערכת בניית גיליון תא ריאלי ויעיל דרוש בדחיפות.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים כדי להכין גיליון התא של תאי גזע (MSC) multilayeredmesenchymal. במערכת זו בנייה ‘, גיליון התא חוזק מכני מסופק על ידי DPP. על סמך זה לגרדום, מבנה תלת-ממדי התא יכול להיות במהירות נבנה עם RAD16-אני הידרוג פפטיד, ומערכת דינמי זלוף משמש תרבות הגיליון תא מרובה שכבות, על מנת לייצב את מבנה גליון התא תלת-ממד, לספק תזונה מספקת ספק עבור התאים. באמצעות מערכת זו, גיליון BMSC מרובה שכבות הוכן בהצלחה, הציג השפעה טיפולית אופטימלית על מודל אוטם שריר הלב13חולדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי מדווח שיטה יעילה עבור בניית גיליון MSC מרובה שכבות. גיליון זה תא תערוכות אופטימלית חוזק מכני, צפיפות זריעה תא גבוה ו אתריים חיובית לתאי גזע. כדוגמא BMSCs, מבנה תלת-ממדי התא במהירות נבנה עם RAD16-אני הידרוג פפטיד. לאחר להיות תרבותי במערכת דינמית זלוף, הגיליון BMSC מרובה שכבות בהצלחה …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (גרנט מספר 31771064); מדע, טכנולוגיה תכנון הפרוייקט של בפרובינצית גואנג-דונג (גרנט מספרים 2013B010404030, 2014A010105029 ו- 2016A020214012); מדע, טכנולוגיה תכנון הפרוייקט של גואנגזו (גרנט מספר 201607010063); חדשנות לתואר ראשון ואת תוכנית האימונים יזמות (גרנט מספר 201610559028); הקרן הלאומית למדע עבור סין של מדענים צעירים (להעניק מספר 31800819).
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
Riferimenti
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).
- Narita, T., et al. The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure. Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).
- Matsuo, T., et al. Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction. Circulation. 128 (22), (2013).
- Alshammary, S., et al. Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction. Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).
- Chen, G. P., et al. The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).
- Cerqueira, M. T., et al. Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).
- Ishii, M., et al. Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).
- Godier-Furnemont, A. F., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Liu, Y., et al. Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction. American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).
- Arana, M., et al. Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction. Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).
- Wang, Y., et al. Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system. Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).
- Wu, Z., et al. The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).
- Degano, I. R., et al. The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation. Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).
- Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials. Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).
- Cui, X. J., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).
- Jun, I., et al. Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).
- Chen, C. H., et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).
