Opførelse af et flerlaget mesenkymale stamceller ark med en 3D dynamisk kultur System
Summary
Denne artikel giver en effektiv og gennemførlig metode til at konstruere flerlaget stamcelle ark med gunstige stamcelle ejendom.
Abstract
Stamcelleterapi viser en lovende fremtid i regenererende skadede organer og væv, og celle ark teknik er udviklet til at forbedre lav celle fastholdelse og dårlig overlevelse inden for pulszonen. Men under byggeprocessen in vitro- en løsning for at bevare stamceller bioactivity og øge celle i arket celle er tvingende nødvendigt. Her, præsenterer denne protokol en metode til at konstruere et flerlaget celle ark med gunstige stamcelle bioactivity og optimal brugervenlighed. Decellularized svin hjertesækken (DPP) er udarbejdet af fosfolipase en2 (PLA2) decellularization metode som celle ark stillads, og rotte knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSCs) er isoleret og udvidet som seedede cellerne. Midlertidig flerlaget celle ark struktur er opbygget ved hjælp af RAD16-jeg peptid hydrogel. Endelig arket celle er kulturperler med en dynamisk perfusion system til at stabilisere strukturen tredimensionale (3D), og arket celle kunne opnås efter en 48-timers kultur i vitro. Denne protokol giver en effektiv og gennemførlig metode til at konstruere et flerlaget stamcelle ark, og arket celle kan udvikles som en gunstig stamcelle terapi produkt i fremtiden.
Introduction
Stamcelleterapi er blevet rapporteret som en effektiv behandling af mange sygdomme; men lav celle fastholdelse og dårlig overlevelse inden for pulszonen fortsat kritiske spørgsmål efter traditionelle stamcelle injektion. For at løse dette problem, udviklet tissue engineering forskere celle ark teknik. En monolayered celle ark med intakt ekstracellulære matrix blev først udarbejdet ved hjælp af temperatur-respons kultur parabol1, og dens opfølgende undersøgelser rapporterede de betydelige forbedringer af stamceller fastholdelse og overlevelse inden for de infarcted område2,3. Blandt metoderne, er konstruere arket flerlaget celle blevet rapporteret som en effektiv strategi for at forbedre celle overlevelse og celle ark terapeutiske virkning3,4. Siden da, har forskere arbejdet på at udvikle forskellige celle ark byggemetoder for at øge celle beløb, stamcelle ejendom og mekaniske ejendom celle ark. Hidtil, visse typer af celle ark er blevet konstrueret og studerede i behandlingen af myokardieinfarkt5, brusk skade6, og huden sår7.
Bioactivity af stamceller før transplantation viste en spirende indflydelse på tilskadekomne væv revitalisering, og forskellige celle ark byggeri strategier har forskellige virkninger på stamcellerne. På den ene side sammenflydende celle plader kun bestod af high-density stamceller og naturlige ekstracellulære matricer kan erhverves ved stabling monolayered celle ark8 eller magnetiske tissue engineering teknikker9. På den anden side udviklet forskere forskellige stilladser for at yde passende mekanisk styrke og støtte celle vækst10,11,12, der tillod en lav stamcelle såning tæthed for at sikre ernæring levering. Trods disse tilgange forbliver lav effektiv ernæring levering inden for ark flerlaget cellestruktur dog en større bekymring under in vitro- konstruktion. En effektiv og gennemførlig celle ark byggeri system er derfor et presserende behov.
Denne protokol beskriver trin for at forberede en multilayeredmesenchymal stamceller (MSC) celle ark. I denne konstruktion system, er cellen ark mekanisk styrke fastsat af en DPP. Baseret på denne stillads, 3D cellestruktur kan hurtigt opbygges med RAD16-jeg peptid hydrogel, og en dynamisk perfusion system bruges til kultur arket flerlaget celle for at stabilisere 3D ark cellestruktur og give tilstrækkelig ernæring levering til cellerne. Ved hjælp af dette system, et flerlaget BMSC ark var med held forberedt og udstillet en optimal terapeutisk effekt på rotte myokardieinfarkt model13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol rapporterer en effektiv metode til at konstruere et flerlaget MSC ark. Denne celle ark udstiller optimal mekanisk styrke, høj celle seeding tæthed og gunstige stamcelle bioactivity. Bruger BMSCs som et eksempel, 3D cellestruktur er hurtigt bygget med RAD16-jeg peptid hydrogel. Efter at være kulturperler i dynamisk perfusion system, arket omfangsrige BMSC er med succes opnået og BMSCs bevare et højt udtryk af stamceller markører.
Konstruere midlertidig flerlaget cellestrukt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den National Natural Science Foundation of China (grant nummer 31771064); Videnskab og teknologi planlægger projektet af Guangdong-provinsen (grant numre 2013B010404030, 2014A010105029 og 2016A020214012); Videnskab og teknologi planlægger projektet i Guangzhou (grant nummer 201607010063); og bachelor Innovation og Entrepreneurship træningsprogram (grant nummer 201610559028); National Science Foundation for unge forskere i Kina (giver nummer 31800819).
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
Riferimenti
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al. The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects. International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).
- Narita, T., et al. The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure. Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).
- Matsuo, T., et al. Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction. Circulation. 128 (22), (2013).
- Alshammary, S., et al. Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction. Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).
- Chen, G. P., et al. The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).
- Cerqueira, M. T., et al. Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).
- Ishii, M., et al. Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).
- Godier-Furnemont, A. F., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Liu, Y., et al. Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction. American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).
- Arana, M., et al. Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction. Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).
- Wang, Y., et al. Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system. Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).
- Wu, Z., et al. The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).
- Degano, I. R., et al. The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation. Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).
- Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials. Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).
- Cui, X. J., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).
- Jun, I., et al. Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).
- Chen, C. H., et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).
