アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出
Summary
ここでは、蛍光活性化細胞ソーティングによってアポトーシス乳癌細胞を分離し、さらにフローサイトメトリーによるアポトーシス反転後乳癌幹細胞のような細胞非幹乳ガン細胞の転移を検出するためのプロトコルを提案する.
Abstract
癌の再発は、基になるメカニズムは不明ながら専門医により研究されている長い。最近では、私たちと他の人、というアポトーシス逆転現象がさまざまな刺激の下で様々 な細胞モデルに増加した腫瘍につながることを発見します。In vitro および in vivo; このプロセスのトラッキングに関する以前の研究が注目されています。ただし、真逆の細胞の分離はまだ達成されるべきアポトーシス逆転の影響に関する我々 の理解を制限します。ここでは、我々 を活用カスパーゼ 3/7 グリーン検出色素ラベル カスパーゼ活性化細胞にアポトーシス誘導後。肯定的な信号を細胞が蛍光活性化セル (FACS) を回復の並べ替えによって選別してさらに。共焦点顕微鏡形態学的検査は、FACS 前に、アポトーシスの状態を確認できます。腫瘍の増加がしばしば癌幹細胞 (CSC) の割合の上昇に起因する-セルのように。また、乳がんの多様性を与えられて、これらの CSC のような細胞の起源を識別する重要になるがん治療。したがって、我々 はアポトーシスを誘発、カスパーゼ活性化細胞を分離してアポトーシスの反転手順を実行する前に乳癌以外の幹細胞を準備します。フローサイトメトリー解析では、乳房 CSC のような細胞が乳房 CSC のような細胞がアポトーシス反転中に乳癌以外の幹細胞から通過を示す逆のグループに再表示されることを明らかにします。要約すると、このプロトコルには、フローサイトメトリーによるアポトーシス乳癌細胞の分離と逆セルに CSC 割合の変化の検出が含まれます。
Introduction
がん国世界中1の大きな負担の原因と死の主要な原因となっています。乳がんは、がん1のすべてのタイプの間で女性患者の両方の発生率と死亡率の面で高いランクします。がんの多様性により化学療法でがん細胞死2,3、4を達成するために薬の組み合わせを使用する通常は。ただし、9、急速に成長している細胞は、タンパク質合成7,8や微小管ダイナミクス以来、一般的な化学療法薬は、しばしば DNA5,6をターゲットとしながら最も影響を受けるがん幹細胞 (CSC) s など休止期の細胞は、通常影響の少ない10です。CSCs は、したがって、治療、薬剤耐性やがんにつながる後再発10,11のちにも生き残る可能性が高い。したがって、CSCs の除去がん治療の重要な話題となっている、CSCs の起源の研究は必要です。
アポトーシスの逆転現象に関するより多くの研究は、最近 10 年間・12,13,14,15,16,17,18で行われています。,19. この概念の出現する前に広く受け入れられて細胞が不可逆的カスパーゼ活性化後アポトーシスを受けること。カスパーゼはアポトーシス、複雑なアポトーシスの形成と下流の基板20の胸の谷間などの開始と実行の段階で重要な役割を果たすタンパク質酵素の家族です。カスパーゼ 3 やカスパーゼ 7 など死刑執行カスパーゼの活性は、”ノーリターンのポイント「アポトーシス21として考えられています。しかし、研究者は最近観察アポトーシス反転体外の両方に発生し、セルの中に体内の,は、カスパーゼ活性化12,13,14後もアポトーシスから回復できます。,15,16,17,18,19します。 さらに、積極的な機能など元アポトーシス誘導と高い侵襲性に高い抵抗が逆のがんで検出された細胞の15。したがって、それは CSC のような細胞の割合が逆の人口未処理細胞と比較して最終的にアポトーシス逆転18後より悪性の機能に貢献して高くなる提案されました。
以前は、多くの努力がなされたアポトーシス反転体外ともっと重要なは、生体内での追跡にこのプロセス16,17,19の普遍性を確認するのに大きく役立つ。ただし、全身逆セルの結果考察はアポトーシス逆転に本当に影響を受けた細胞の不十分な分離のために欠けています。純粋なアポトーシス細胞を取得し、さらなる研究のためにそれらを回復する必要があります。したがって、我々 は”ノーリターンのポイント「21 apoptosis ためのマーカーとして死刑執行カスパーゼ活性化伝統的に広く受け入れられたマーカーを使用し、蛍光活性化細胞のカスパーゼ活性化細胞染色を区別する (FACS) を並べ替えを利用カスパーゼ-3/7 グリーン検出染付。染料は、短いアミノ酸シーケンスが認識され、アクティブなカスパーゼ 3/7 は切断する DEVD 共有にリンクされます。開裂の細胞質から核 DNA に結合して強い蛍光を発する場所に若しは染料を解放に役立ちます。この手順は、いくつかの細胞が行われていないことアポトーシス一括セル人口を使用して回避できます。
CSCs または腫瘍幹細胞は単一を使って多くの固体腫瘍で確認されている、またはいくつかの表面マーカーとこれらの細胞の非常にいくつかの数字の組み合わせが、免疫不全マウス22,23、形態の腫瘍に十分です 24,25,26,27。CD44 と CD24 の組み合わせは胸 CSC 研究と CD44 の一般的使用されています+/CD24–細胞は胸 CSCs26,27,28,29として定義されています。,30最近、一連のアポトーシス反転と CSCs の提案の関係を確認し、逆の乳房のがん細胞は in vitro および in vivo での増加の腫瘍形成能を得たことを示す実験を行ったが、。CSC マーカー18細胞の高い割合です。私たちが胸 CSCs より生き残る、従って得る豊かアポトーシス反転後重要なは、我々 は非幹細胞と件名を分離するときする可能性を除かないが、もともと非幹アポトーシス反転、CSC に出てくるがん細胞集団、示唆非幹がん細胞はアポトーシス反転中 CSCs の割合の増加に貢献できます。
この記事は、アポトーシス反転後乳癌以外の幹細胞から胸 CSC 様細胞への移行を示すとフローサイトメトリーによるこの転移を検出するために目指しています。乳癌以外の幹細胞は、CD44 を分離することによって準備最初–/CD24+ FACS による癌細胞の乳房します。アポトーシスが誘発し、顕微鏡下での形態学的変化によって確認されました。その後、アポトーシスはカスパーゼ 3/7 グリーン検出色素によって積極的にラベルは FACS により分離、さらにアポトーシスの反転のアポトーシス誘導物質の不在で培養します。逆セル、フローサイトメトリーによる解析のための回復の 7 日後 CSC マーカーとに汚れます。CD44 細胞+/CD24 逆の人口に–マーカーが再表示されますアポトーシス反転中に非幹細胞から CSC 様細胞への移行が発生したことを示唆しています。
アポトーシスの反転は、複数のがんで観察されている正常細胞と同様に細胞培養12,13異なるアポトーシス誘導刺激で治療します。このプロセスは、ショウジョウバエにトレースされている体内の16,17,19のモデルします。本稿で説明するよう、技術を使用して異なった癌疾患モデルと CSCs の起源で癌再発のメカニズムに関する多くの情報を取得できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、乳癌非幹細胞のアポトーシス逆転の結果乳癌 CSC のような細胞への移行を検出するための直接かつ明確な方法について説明します。これらの逆の細胞の CSC プロパティの確認は私n vitro mammosphere 形成アッセイとin vivo異種移植による免疫不全マウス18,24,26 アシストでした。 ,<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、革新的な技術基金の革新技術委員会によって支えられた: 状態キー研究所の Agrobiotechnology (香港中文大学)、Lo Kwee 成医学研究基金とリー Hysan 基礎からの資金調達サポート。情報は、香港中文大学の大学院学生の身分によって支えられました。
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
Riferimenti
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