جسيمات نانوية المغلفة بولييثيلينيميني أكسيد الحديد كوسيلة لإيصال الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة إلى الضامة في المختبر و في فيفو
Summary
يصف لنا طريقة استخدام بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)-مغلف بأكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك جسيمات نانوية الضامة ترانسفيكتينج مع siRNA. يمكن تقديم هذه الجسيمات النانوية كفاءة siRNA الضامة في المختبر و في فيفو والصمت في التعبير الجيني المستهدف.
Abstract
بسبب دورها الحاسم في تنظيم الاستجابات المناعية، الضامة خضعت بشكل مستمر من البحث المكثف، وتمثل هدفا علاجية واعدة في اضطرابات كثيرة، مثل أمراض المناعة الذاتية، وتصلب الشرايين، والسرطان. إسكات الجينات بوساطة [رني] نهج قيمة الاختيار للتحقيق والتعامل مع الدالة بلعم؛ ومع ذلك، تعداء الضامة مع siRNA ويعتبر غالباً ما تكون صعبة من الناحية التقنية، وفي الوقت الحاضر، تتوفر بعض المنهجيات مخصصة لنقل siRNA إلى الضامة. نقدم هنا، على بروتوكول لاستخدام جسيمات نانوية المغلفة بولييثيلينيميني أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك (بي-سبيونس) كوسيلة لإيصال siRNA المستهدفة إلى الضامة. بي-سبيونس قادرون على الملزمة والتكثيف siRNA تماما عندما تصل نسبة وزن الحديد: siRNA 4 وما فوقها. في المختبر، هذه الجسيمات النانوية يمكن أن كفاءة تسليم siRNA الضامة الأولية، وكذلك في خط الخلية 264.7 الخام مثل بلعم، دون تعريض بقاء الخلية في الجرعة المثلى تعداء،، وفي نهاية المطاف، أنها تحفز الهدف بوساطة siRNA إسكات الجينات. وبصرف النظر عن تستخدم في المختبر تعداء siRNA، بي-سبيونس أيضا أداة واعدة لتقديم siRNA الضامة في فيفو. وبالنظر إلى ميزاته مجتمعة الخاصية المغناطيسية والقدرة على إسكات الجينات، ينتظر تدار النظامية بي-جاسوس/siRNA الجسيمات تعدل الدالة بلعم بل أيضا لتمكين الضامة إلى تصويرها وتعقبها. في جوهرها، بي-سبيونس تمثل منبرا فاجيناليس بسيطة وآمنة وفعالة لإيصال siRNA إلى الضامة على حد سواء في المختبر و في فيفو.
Introduction
الضامة نوع من الخلايا المناعية الفطرية التي وزعت في جميع أنسجة الجسم، أن كان ذلك بمقادير مختلفة. بإنتاج مجموعة متنوعة من السيتوكينات والوسطاء الآخرين، أنها تلعب أدواراً حاسمة في الدفاع المضيف ضد غزو الجراثيم المسببة للأمراض وفي إصلاح الأنسجة بعد الإصابة، وفي الحفاظ على التوازن الأنسجة1. بسبب أهميتها، قد الضامة باستمرار موضوع البحث المكثف. ومع ذلك، على الرغم من انتشاره في تنظيم الجينات ودراسات مهمة، إسكات الجينات siRNA بوساطة أقل احتمالاً لينجح في الضامة لهذه الخلايا – خاصة، الضامة الأولية – غالباً ما تكون صعبة ترانسفيكت. وهذا يمكن أن يعزى إلى درجة عالية نسبيا من السمية المرتبطة بنهج تعداء الأكثر الراسخة التي يكون فيها غشاء الخلية كيميائيا (مثلاً، مع البوليمرات والدهون) أو ماديا (مثلاً، انهانسر و تعطل الجينات البنادق) للسماح siRNA الجزيئات عبر الغشاء، الحد بشكل كبير وبالتالي الضامة جدوى2،3. وعلاوة على ذلك، يتم الضامة الغنية في إنزيمات بوليمرات مخصصة البالعات. يمكن أن تتلف هذه الإنزيمات سلامة siRNA، إضعاف كفاءته إسكات حتى إذا تم تسليم siRNA الخاصة بالجينات في الخلية3،4. ولذلك، يحتاج نظام تسليم siRNA فعالة تستهدف بلعم لحماية سلامة واستقرار siRNA أثناء تسليم4.
من الواضح بصورة متزايدة أن الضامة مختلة متورطون في بدء وتطور بعض الاضطرابات السريرية الشائعة مثل أمراض المناعة الذاتية، وتصلب الشرايين والسرطان. ولهذا السبب، تحوير وظيفة بلعم مع، على سبيل المثال، siRNA، الناشئة بطريقة جذابة لعلاج هذه الاضطرابات5،،من67. على الرغم من أن قدرا كبيرا من التقدم قد أحرز، تحديا رئيسيا لاستراتيجية العلاج القائم على siRNA من خصوصية خلية الفقراء siRNA تدار النظامية وامتصاص siRNA غير كافية بالضامة، مما يؤدي بالتالي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها. بالمقارنة مع العلاجات مجاناً الحمض النووي التي تفتقر عادة إلى الانتقائية الخلية المثلى، وغالباً ما يؤدي إلى آثار سلبية، محملة بالمخدرات جسيمات نانوية (NPs)، سبب ميلها العفوي لإلقاء القبض عليه من قبل نظام شبكي، الهدف يمكن أن يكون إجراء هندسة عكسية لاستهداف السلبي إلى الضامة في فيفو، مما يسمح لتحسين الفعالية العلاجية مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية8. وتشمل NPs الحالية استكشافها لإيصال جزيئات الحمض النووي الريبي نانوكاريرس غير العضوية والدهنية المختلفة والبوليمرات9. فيما بينها، بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)، نوع من البوليمرات الموجبة قادرة على الربط والتكثيف الأحماض النووية إلى استقرار مصادر القدرة النووية، يظهر أعلى الجيش الملكي النيبالي تسليم9،قدرة10. برينس يحمي الأحماض النووية من تدهور الانزيمية ونونينزيماتيك ويتوسط نقلها عبر غشاء الخلية، ويعزز الإفراج عنهم داخل الخلايا. على الرغم من أن عرض في البداية ككاشف إيصال الحمض النووي، تجلى بي فيما بعد لتكون منصة جذابة في فيفو siRNA التسليم، أما محلياً أو عناصره9،10.
جسيمات نانوية أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك (سبيونس) وقد أظهرت وعدا كبيرا في الطب الحيوي، وسبب خصائص مغناطيسية، توافق مع الحياة، وحجم مماثلة إلى كائنات هامة بيولوجيا، وارتفاع نسبة مساحة السطح إلى حجم، ويمكن تكييفها بسهولة سطح بيواجينت المرفق11. على سبيل المثال، بسبب فائدتها المحتملة كعامل تباين وسرعة امتصاص الضامة، ظهرت سبيونس كأداة سريرية مفضلة لصورة الأنسجة الضامة12. بينما كما درست سبيونس على نطاق واسع الأحماض النووية تسليم المركبات11،13،14،15، على حد علمنا، الأدب يحتوي على عدد قليل من التقارير من سبيونس كناقل تسليم siRNA بلعم المستهدفة. لإيصال الجينات سبيونس، هي عادة مغلفة سطحها بطبقة من ماء البوليمرات الموجبة التي الأحماض النووية المشحونة سلبيا يمكن الكهربية الاستاتية جذبت والمربوطة. وهنا نقدم طريقة لتجميع سبيونس السطحية التي يتم تعديل مع منخفضة الوزن الجزيئي (كاتشين 10)، تشعبت بي (بي-سبيونس). ثم تستخدم هذه نانوبلاتفورمس المغناطيسي لاختصار siRNA، تشكيل مجمعات بي-جاسوس/siRNA تمكن siRNA النقل داخل الخلية. نحن السبب أن البلعمه عفوية من سبيونس من خلايا نظام شبكي16، مقترنة بقدرة قوية للربط والتكثيف الأحماض النووية بجزيرة الأمير إدوارد، يجعل بي–سبيونس مناسبة للنقل تتسم بالكفاءة ل siRNA في الضامة. دعم البيانات المقدمة هنا جدوى إسكات الجينات بي-جاسوس/siRNA-وساطة في الضامة في الثقافة، وكذلك في فيفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
الضامة الصهر ترانسفيكت بنهج فاجيناليس شائعة الاستخدام، مثل انهانسر والدهنية الأيوني، وأنواع الدهن. هنا وصفت لنا طريقة موثوقة وفعالة ترانسفيكت الضامة مع siRNA. باستخدام هذا البروتوكول، ما يزيد على 90% من مثل بلعم 264.7 الخام الخلايا (الشكل 2B) والفئران الضامة البريتوني1…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان يؤيد هذا العمل “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (81772308) و “البحوث الرئيسية الوطنية” و “برنامج التنمية في الصين” (رقم 2017YFA0205502).
Materials
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
Riferimenti
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -. L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -. Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E., Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
