Differenziazione delle cellule staminali nervose di un One-Step Plasma atmosferico freddo trattamento In Vitro
Summary
Questo protocollo mira a fornire la procedura dettagliata sperimentale di un trattamento al plasma atmosferico freddo su cellule staminali neurali e rilevamento di immunofluorescenza per la valorizzazione di differenziazione.
Abstract
Come lo sviluppo della tecnologia di fisica del plasma, plasmi atmosferici freddi (CAPs) ampiamente sono stati studiati nella decontaminazione, trattamento del cancro, la guarigione della ferita, cura canalare, ecc., formando un nuovo campo di ricerca denominato medicina del plasma. Essendo una miscela di specie reattive elettriche, chimiche e biologiche, tappi hanno dimostrato le loro capacità per migliorare la differenziazione di cellule staminali nervose entrambi in vitro e in vivo e sono diventando una soluzione promettente per il trattamento di malattia neurologica in futuro. La notizia molto più eccitante è che utilizza capsule può realizzare uno stadio e diretto in modo sicuro, differenziazione delle cellule staminali neurali (NSC) per il trasporto del tessuto. Dimostriamo qui il dettagliato protocollo sperimentale di utilizzando un dispositivo di CAP jet self-made per migliorare la differenziazione NSC in C17.2-NSC e cellule staminali neurali del ratto primario, nonché osservando il destino della cellula da invertito e microscopia a fluorescenza. Con l’aiuto della tecnologia di colorazione di immunofluorescenza, abbiamo trovato entrambi la NSC ha mostrata un tasso accelerato di differenziale rispetto al gruppo non trattato, e ~ 75% del NSC differenziato selettivamente nei neuroni, che sono principalmente maturo, colinergici e motore neuroni.
Introduction
La differenziazione di NSC diretto verso una certa linea per il trasporto del tessuto è considerata una delle più promettenti terapie per malattie neurodegenerative e neurotraumatic1. Ad esempio, i neuroni dopaminergici catecholaminergic soprattutto sono desiderati nel trattamento del morbo di Parkinson (PD). Tuttavia, i metodi tradizionali per preparare le cellule desiderate per trasporto hanno molti inconvenienti, come ad esempio tossicità chimica, formazione della cicatrice o altri, che in gran parte ostacola le applicazioni delle CSN in medicina rigenerativa2. Di conseguenza, è molto necessario per trovare un romanzo e un modo sicuro per il differenziamento di NSC.
Il plasma è il quarto stato della materia, seguente solido, liquido e gas, e costituisce oltre il 95% della materia nell’intero universo. Il plasma è elettricamente neutro con unbound positivo/negativo e particelle neutre e viene solitamente generato da una scarica ad alta tensione in laboratorio. Negli ultimi due decenni, l’applicazione del plasma in biomedicina ha attirato grande attenzione in tutto il mondo come lo sviluppo della tecnologia del plasma freddo pressione atmosferica. Grazie a questa tecnica, stabile al plasma a bassa temperatura può essere generato nell’aria circostante atmosfera senza formazione di arco e si compone di varie specie reattive, come specie reattive dell’azoto (RNS), specie reattive dell’ossigeno (ROS), ultravioletto (UV) radiazione, gli elettroni, ioni e campo elettrico3. Tappi presentano i vantaggi unici per inattivazione di microrganismi, la terapia del cancro, cicatrizzazione, trattamento delle malattie della pelle, la proliferazione delle cellule e cellula differenziazione4,5,6,7. Nel precedente lavoro, abbiamo dimostrato che il getto di plasma atmosferico freddo può migliorare il differenziamento di NSC in murino delle cellule staminali neurali C17.2 (C17.2-NSC) e cellule staminali neurali del ratto primario, che esibisce un grande potenziale per diventare un potente strumento per la regia differenziazione di NSC8. Sebbene il meccanismo del potenziamento di CAP di differenziazione NSC completamente non è capito ancora, NO generato da tappi è stato dimostrato di essere un fattore chiave nel processo. In questo lavoro, ci proponiamo di fornire un dettagliato protocollo sperimentale di usando un getto plasma di elio/ossigeno di pressione atmosferica per il trattamento di NSC in vitro, preparazione delle cellule e pretrattamento, osservazione della morfologia di microscopio invertito, e osservazione di microscopia di fluorescenza di immunofluorescenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-NSC è una sorta di linea di cellule staminali neurali immortalata da cellule di strato granulare cerebellare di topo neonatale, sviluppata da Snyder e altri10,11. C17.2-NSC può differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti e sono ampiamente usate in neuroscienze12. Nel nostro studio precedente, tappi potrebbero migliorare la differenziazione delle C17.2-CSN in neuroni. Uno studio di prova-de-principio è stato anche effett…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma di studioso di Huazhong, il fondo per l’innovazione indipendente of la Huazhong University of Science and Technology (n. 2018KFYYXJJ071) e National Natural Science Foundation of China (nn. 31501099 e 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
Riferimenti
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